[发明专利]一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法

摘要

本发明涉及一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBRGreenI荧光定量PCR检测方法，本发明方法步骤包括猪胞内劳森氏菌DNA的提取﹑引物设计﹑PCR扩增PPE的aspA基因片段﹑猪增生性肠炎的aspA基因的克隆与鉴定﹑标准质粒模板的制备﹑荧光定量PCR的扩增并获得扩增动力学曲线和标准曲线﹑特异性试验﹑敏感性试验﹑重复性和稳定性试验及临床病料样品检测。本发明方法具有良好的特异性﹑敏感性﹑重复性和稳定性，能够简便﹑快速﹑特异﹑敏感的对临床疑似PPE感染或发病猪进行准确的鉴别诊断和早期感染的检测监控。

主权项

一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法，其特征在于其检测方法的具体步骤如下:（1）提取猪胞内劳森氏菌的DNA，制备检测液；（2）根据GenBank中的LI aspA基因（AY280626），设计一对特异性引物，引物序列如下：PPE‑1‑F：5‑‑TAT，GGC，TGT，CAA，ACA，CTC，CG‑‑3PPE‑1‑R：5‑‑TGA，AGG，TAT，TGG，TAT，TCT，CC‑‑3其中PPE‑1‑F／R预期扩增片段为227bp；（3）加入PCR Mix 12.5 μL，10 pM上、下游引物各1 μL，Rnase Free water 8.5 μL，DNA模板或重组质粒2.0μL，将EP管置PCR仪，按如下程序进行扩增：94℃ 5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 40s，共35个循环；72℃延伸10 min，反应结束后，取5µL PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，将扩增的PCR产物经2%的凝胶电泳分析并回收﹑纯化；（4）将回收纯化后的PCR产物连接到pMD18‑ T Vector上，转化至感受态细胞，筛选得到单菌落，挑取单个菌落接种至培养液中过夜振荡培养，提取重组质粒，以提取的质粒DNA作为模板进行PCR鉴定，并将重组质粒进行测序鉴定；（5）提取经过测序鉴定正确的重组质粒，应用紫外分光光度计测定重组质粒浓度，计算出基因拷贝数，将重组质粒进行10倍系列稀释，共做6个稀释度：102,103,104,105,106,107，将其作为标准质粒模板；（6）取标准质粒模板，构建反应体系，进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增，获得扩增动力学曲线及标准曲线；（7）分别以TGEV、RV、PEDV反转录后的cDNA和大肠杆菌、沙门氏菌﹑LI阳性对照的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，同时设NTC，,验证本发明方法的特异性；（8）将已计算出拷贝数的质粒做10倍梯度稀释,选取10‑9、10‑10、10‑11、10‑12﹑10‑13稀释的五个浓度梯度进行荧光定量PCR检测,以此确定出荧光定量PCR所能检出的最低模板拷贝数，验证本发明方法的敏感性；（9）将已知的标准品分别进行批内、批间重复性试验，验证本发明中方法的稳定性和重复性；（10）对采自山东省内疑似PPE发病猪的盲肠、回肠组织样品及粪便样品处理后，分别进行荧光定量PCR检测和常规PCR扩增，同时设阳性标准对照和阴性对照，用于对比本发明方法的优良之处。