[发明专利]Lmx1a介导的与神经干细胞共培养诱导rASCs为DA能神经元的方法

摘要

Lmx1a介导的与神经干细胞共培养诱导rASCs为DA能神经元的方法，属于诱导干细胞替代缺损的神经元细胞治疗帕金森氏病的方法。本发明步骤有构建Lmx1a基因克隆及重组质粒，构建与包装重组腺病毒Ad-Lmx1a，将感染Ad-Lmx1a的rASCs与NSCs共培养分化为DA能神经元；以及rASCs和NSCs传代细胞的培养等。本发明诱导的神经元样细胞能分化出表达多巴胺能神经元细胞蛋白标志物，且诱导后的细胞可传导电信号或分泌神经递质，证明诱导细胞为神经元细胞。

主权项

Lmx1a介导的与神经干细胞共培养诱导rASCs为DA能神经元的方法，包括以下步骤：    步骤（1）：构建Lmx1a基因克隆及重组质粒    以Lmx1a whole transcript cDNA（NM_138396）为模板，引物为：    P1 up：5′‑GCGTCGACGTACCATGCTGGACGGCCTAAAG‑3′，    P1 down：5′‑CGGGATCCCGCTTATCAAGATGTGAAGTAAG‑3′，通过PCR扩增获得带SalI和EcoR V酶切位点的DNA片段，将该片段插入pShuttle‑CMV中，通过SalI和EcoR V双酶切鉴定，得到重组穿梭质粒pShuttleCMV‑Lmx1a，测序并与理论结果一致；    步骤（2）：构建与包装重组腺病毒Ad‑Lmx1a将步骤（1）重组穿梭质粒pShuttleCMV‑Lmx1a先后用PmeI线形化和CIAP进行5′去磷酸化，其产物经纯化后与腺病毒基因组pAdEasy‑1同时电转感受态细胞BJ‑5183，得同源pAdEasy‑1重组质粒，筛选阳性克隆，与pAdEasy‑1成功进行同源重组的克隆能被PacI酶切出3.0kb或者4.5kb的片段；筛选出的pAdEasy‑1重组质粒经鉴定后转化XL‑10(Gold),扩增、提取质粒，使质粒浓度达到0.1μg/μL，将质粒线性化后转染HEK‑293细胞，使重组腺病毒质粒在HEK‑293细胞中包装重组腺病毒Ad‑Lmx1a，10天后细胞病变脱落呈串珠状，漂浮于上清液中，收集腺病毒颗粒；    步骤（3）：将感染Ad‑Lmx1a的rASCs与NSCs共培养分化为DA能神经元（a）诱导前，取rASCs第二代细胞，接种于放有玻片且包被过多聚赖氨酸的六孔培养板，培养液为含10%FBS的L‑DMEM；培养的NSCs接种于transwell小室中，培养液为含2% B27的Neural Basal培养液;（b）以最佳MOI的Ad‑Lmx1a感染rASCs，并将培养液更换为含2% B27的Neural Basal培养液，使细胞贴壁率维持在85%，三天后再换液为DMEM/F12诱导液I进行预诱导，部分细胞开始聚集；以上DMEM/F12诱导液I由以下成分组成：2%FBS，1.7 µM SHH，20 ng/mLbFGF，6 mM β‑巯基乙醇，DMEM/F12培养基;（c)将接种有NSCs的transwell小室放入接种有（b）的产物细胞的六孔板中，NSCs与（b）的产物细胞在含2% B27的Neural Basal培养液中共培养24h，细胞数目明显增多，3天后将诱导液换液为Neural Basal正式诱导液II，每隔3天换一次诱导液II，直至21天；以上Neural Basal正式诱导液II由以下成分组成：2%B27，1.7 µM SHH,100 ng/mLFGF‑8,20 ng/mLbFGF, 1% N2 supplement，20 µM β‑NADP，Neural Basal培养基。