[发明专利]骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的诱导方法

摘要

本发明提出一种骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的诱导方法，包括分离培养细胞，间充质干细胞的形态学观察，流式细胞仪检测抗原表达，诱导分化实验以及细胞免疫荧光染色。所述方法应用全反式维甲酸、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞，不仅具有了神经细胞的典型形态，并表达神经元标志抗原神经元特异性烯醇化酶、星型胶质细胞标志抗原胶质纤维酸性蛋白；提示骨髓间充质干细胞保留了跨胚层分化为非间充质细胞的能力，可跨胚层分化为神经元样细胞，有望成为神经细胞替代治疗的种子细胞。

主权项

一种骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的诱导方法，其特征在于，其应用全反式维甲酸、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞，所述诱导方法包括如下步骤：分离培养细胞，BMSCs的形态学观察，流式细胞仪检测抗原表达，诱导分化实验以及细胞免疫荧光染色；其中，所述的分离培养细胞步骤具体为：在无菌条件下收集骨髓，肝素抗凝收集的骨髓悬液，D‑Hanks液稀释，缓慢加在一半体积的Ficoll分离液上，600g离心15分钟，收集界面层细胞，用D‑Hanks液洗1遍，调整细胞浓度为1×105/ml，接种于25cm2的培养瓶，在饱和湿度静置培养，当细胞密度达到70％融合后用0.25％的胰蛋白酶消化，按照1瓶分2瓶的比例传代培养；所述的BMSCs的形态学观察步骤具体为：在倒置相差显微镜下每日观察原代和传代细胞的生长情况和形态特征，并摄片记录；所述的流式细胞仪检测抗原表达步骤具体为：取2‑3代培养细胞用0.25％的胰蛋白酶消化后，用含1％小牛血清白蛋白PBS液调整细胞至5×106/ml；取50ul细胞悬液，分别加入下列鼠抗人单克隆抗体：CD34‑FITC、CD45‑PE、CD29‑FITC、CD44‑PE、CD105‑FITC、CD106‑FITC，置4℃孵育30分钟，PBS洗2次，进行流式细胞仪分析；所述诱导分化实验的步骤具体为：取2‑3代培养细胞，分别接种于6孔板，生长密度达到60％时，换成诱导培养基，在37℃、5％CO2下饱和湿度静置培养；以及所述细胞免疫荧光染色的步骤具体为：培养细胞在诱导分化3天后采用免疫荧光染色。