[发明专利]鹰嘴豆种子中蛋白类型α‐淀粉酶抑制剂的提取分离方法

摘要

本发明属于食品科学生物活性成分分离纯化领域，涉及一种鹰嘴豆种子中蛋白类型α-淀粉酶抑制剂的提取分离方法。本发明以鹰嘴豆成熟种子为材料，经提取液浸提-适温加热-硫酸铵分级沉淀-离子交换色谱-高效液相反相色谱对鹰嘴豆种子中所含蛋白类型α-淀粉酶抑制剂进行分离纯化。目前，经多次实验证明，采用此提取方法可分离到两种蛋白类型α-淀粉酶抑制剂，其中一个属鹰嘴豆清蛋白，分子量约为25.0kDa，具植物凝集素作用，在NCBI中基因序列号为gi|339961380；另一个属鹰嘴豆球蛋白，分子量约为60.0kDa，在NCBI中基因序列号为gi|75266099。该分离方法得到目的蛋白多，纯度高，α-淀粉酶抑制活性强，提取程序简便，是一套适用于鹰嘴豆种子中蛋白类型α-淀粉酶抑制剂的提取分离方法。

主权项

一种适宜于鹰嘴豆种子中蛋白类型α‑淀粉酶抑制剂的提取分离方法，其特征在于包含如下步骤： （1）采用成熟收获的鹰嘴豆种子，晒干，磨碎成豆粉； （2）制备的豆粉，按5mL蛋白提取液：1g豆粉比例加入预冷的蛋白提取液，4℃充分搅拌混合3h；蛋白提取液为pH=8.0，且含有500mmol/L NaCl、2mmol/L PMSF、1％β‑巯基乙醇和10mmol/L EDTA‑Na2的10mmol/L的Tris‑HCl缓冲液； （3）混合物于12000×g，4℃下离心10min，取上清液； （4）上清液70℃水浴5min，期间不断摇动使液体受热均匀，于12000×g，4℃下离心10min，取上清液，即为α‑淀粉酶抑制剂的粗提液； （5）将α‑淀粉酶抑制剂粗提液进行硫酸铵分级沉淀，收集各级沉淀物； （6）分别取具有较高α‑淀粉酶抑制活性的硫酸铵饱和度60％‑80％和80％‑100％的分级蛋白沉淀透析除盐，透析结束后冷冻干燥； （7）对上述两种透析除盐后的硫酸铵分级蛋白沉淀，分别利用离子交换色谱进行蛋白纯化分离，收集具有α‑淀粉酶抑制活性的蛋白进行透析除盐，并在冷冻干燥机上冷冻干燥。 所述的离子交换色谱条件如下： ①液相色谱仪采用AKTA prime蛋白纯化系统，离子交换柱为HiPrep16/10QXL； ②缓冲液A为20mmol/L的Tris‑HCl，pH=8.0，缓冲液B为1.0mol/L的NaCl； ③用20mmol/L，pH=8.0Tris‑HCl溶解蛋白粉末，蛋白浓度为40mg/mL，上样体积为2mL，缓冲液流速为3mL/min，洗脱体积为200mL； ④洗脱方式采用梯度洗脱； （8）硫酸铵饱和度60％‑80％分级蛋白沉淀上样活性峰出峰时间为37min，硫酸铵饱和度80％‑100％分级蛋白沉淀上样活性峰出峰时间也为37min。对上一步得到的两种具有α‑淀粉酶抑制活性的蛋白，分别进一步采用高效反相液相色谱法进行蛋白纯化分离，收集具有α‑淀粉酶抑制活性的蛋白成分真空冷冻干燥，即制备得到两种蛋白类型α‑淀粉酶抑制剂冻干粉。 所述的高效反相液相色谱条件如下： ①液相色谱仪采用AKTA purifier液相系统； ②缓冲液A为含0.05％ TFA的超纯水，缓冲液B为含0.05％ TFA的乙腈； ③用超纯水溶解蛋白粉末，蛋白浓度为5mg/mL，上样体积为100μL，缓冲液流速为1.0mL/min，洗脱梯度乙腈浓度为5％‑100％； ④洗脱方式采用梯度洗脱。 （9）从硫酸铵饱和度80％‑100％分级蛋白沉淀分离得到的具有α‑淀粉酶抑制活性的蛋白浓缩后经SDS‑PAGE电泳，测得其分子量约为25.0kDa，此SDS‑PAGE电泳蛋白条带经基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪（MALDI TOF‑TOF）鉴定，并根据获得的肽段信息，经网上搜索比对NCBI数据库，确定该纯化所得蛋白为一种鹰嘴豆清蛋白，具植物凝集素作用，其在NCBI中基因序列号为gi|339961380；从硫酸铵饱和度60％‑80％分级蛋白沉淀分离得到的具有α‑淀粉酶抑制活性的蛋白浓缩后经SDS‑PAGE电泳，测得其分子量约为60kDa，此SDS‑PAGE电泳蛋白条带经LC‑MS/MS鉴定，并根据获得的肽段信息，经网上搜索比对NCBI数据库，确定此蛋白为一种鹰嘴豆球蛋白，其在NCBI中基因序列号为gi|75266099。