[发明专利]制备多能心血管前体细胞及维持其心血管分化能力的方法

摘要

本发明涉及制备多能心血管前体细胞及维持其心血管分化能力的方法。首次揭示一种高效诱导多能干细胞分化为多能心血管前体细胞的方法，包括采用抗坏血酸、骨形成蛋白4和糖原合成酶激酶3抑制剂进行诱导。本发明还提供了稳定培养多潜能心血管前体细胞的方法，包括采用BMP信号通路抑制剂，Activin/Nodal信号通路抑制剂和糖原合成酶激酶3信号通路抑制剂使之稳定生长和传代。本发明获得的多潜能心血管前体细胞，能够进一步分化为心血管谱系的一些细胞如心肌细胞、血管平滑肌细胞或血管内皮细胞，可用于心脏疾病的治疗和心肌再生研究、药物心血管细胞毒性检测、心脏药物的开发。

主权项

1.一种制备心血管前体细胞的方法，包括：(1)以抗坏血酸、骨形成蛋白4和糖原合成酶激酶3抑制剂CHIR99021诱导多能干细胞，使之分化为心血管前体细胞；所述的多能干细胞是胚胎干细胞或诱导性多能干细胞，所述的胚胎干细胞选自：H1，H7，H9、H13、H14和H19；上述诱导过程中，所述的多能干细胞用含有Rho激酶抑制剂Y27632的CIM培养基培养15‑30小时；之后用不含Rho激酶抑制剂Y27632的CIM培养基继续培养40‑60小时；所述的CIM培养基是以DMEM/F12培养基为基础，加入了：0.8‑5％v/v B27添加物，0.3‑3％v/v L‑谷氨酰胺，0.3‑3％v/v青‑链霉素，100‑800μMα‑硫代甘油，30‑80μg/ml抗坏血酸，15‑60ng/ml骨形成蛋白4，1.5‑5μM糖原合成酶激酶3抑制剂CHIR99021；(2)获得心血管前体细胞之后，还包括以CPM培养基稳定培养心血管前体细胞的步骤；所述的CPM培养基是以DMEM/F12培养基为基础，加入了：0.8‑5％v/v B27添加物，0.4‑3％v/v N2添加物，0.3‑3％v/v L‑谷氨酰胺，0.3‑3％v/v非必需氨基酸储存液，0.3‑3％v/v青‑链霉素，0.05‑0.3mMβ‑巯基乙醇，100‑800μMα‑硫代甘油，1.5‑4μM dorsomorphin，0.3‑1μM A83‑01，2‑4μM CHIR99021。