[发明专利]一种提取及培养间充质干细胞的方法

摘要

本发明提出了一种提取及培养间充质干细胞的方法，包括步骤：1)富含血小板的血浆的制备；2)脂肪间充质干细胞的分离提取；3)脂肪间充质干细胞的培养；提供了一种安全、稳定、快速、高质量扩增间充质干细胞的培养体系，避免了使用胎牛血清带来的各种弊端，且解决了现有技术中完全培养基的配置费时费力，培养状态容易受单一成分的影响，质量低的问题。

主权项

一种提取及培养间充质干细胞的方法，其特征在于，包括下列步骤：1)将150～250ml血液，放在肝素钠抗凝管中，在2～8℃保存；2)将上述制得的抗凝血1500～2100r/min离心8～12min，血液分层，取上层液体部分得到富含血小板的血浆，将所述富含血小板的血浆在2～8℃下保存1～7天备用或在‑75～‑85℃下长期保存备用；3)将5～10mL的脂肪组织静置8～12min后分层，移除下层红细胞聚集区的液体；4)用添加有抗生素的磷酸盐缓冲液30～40ml重悬脂肪组织，1200～1800r/min离心3～7min洗涤上述去除红细胞后的脂肪组织一次；5)用质量浓度为0.05～0.15％的I型胶原酶悬浮上述洗涤后脂肪组织，其中所述胶原酶和所述洗涤后的脂肪组织的体积比为1.5∶1～2.5∶1，混匀后置于37℃水浴中消化，开始计时，并每隔1～3分钟振荡该悬液；6)上述消化18～22min后，加磷酸盐缓冲液20～30ml稀释，1400～1600r/min离心3～7min，未消化好的脂肪组织聚集在上层，吸出未消化好的脂肪组织重复步骤(5)；消化下来的单个细胞沉淀在离心管底部，将中间层液体倒出，下层沉淀加DMEM悬浮，100目筛网过滤去除杂质，1300～1700r/min离心4～8min，弃上清液，底部细胞加入8～12ml的DMEM培养基，吹打均匀；7)将步骤6)中第二次消化的脂肪组织于消化后13～17min，加磷酸盐缓冲液20～30ml稀释，1400～1600r/min离心3～7min，未消化好的脂肪组织聚集在上层，吸出未消化好的脂肪组织重复步骤(5)；消化下来的单个细胞沉淀在离心管底部，将中间层液体倒出，下层沉淀加DMEM悬浮，100目筛网过滤去除杂质，1300～1700r/min离心4～8min，弃上清液，底部细胞加入8～12ml的DMEM培养基，吹打均匀；8)将步骤7)中第三次消化的脂肪组织于消化后8～12min，加磷酸盐缓充液20～30ml稀释，1400～1600r/min离心5～7min，倒掉上层脂肪油滴和液体，下层沉淀加DMEM悬浮，100目筛网过滤去除杂质，1400～1600r/min离心5～7min，底部细胞加入8～12ml的DMEM培养基，吹打均匀；9)将步骤6)、7)和8)中收集的细胞悬液汇合，1400～1600r/min离心4～6min；弃上清液，加入完全培养基吹打均匀，台盼蓝染色，用计数板计数后， 按1×105/mL的密度接种于25cm2培养瓶中，在37℃、体积含量5％CO2、95％湿度条件下培养；10)培养24～48小时后，收集培养瓶中1/2的细胞培养基1400～1600r/min离心4～6min，红细胞沉淀在离心管底部，收集上层培养基并按1∶1的比例添加新配制的完全培养基以替代培养瓶中剩余1/2的培养基完，以后每2～3.5天换液，记为P0代。