[发明专利]检测二化螟对Cry1Ac毒素抗药性的方法

摘要

本发明公开了一种检测二化螟对Cry1Ac毒素抗药性的方法，该方法包括二化螟中肠刷状缘膜囊泡的提取、双向电泳分离、酶联免疫反应、显色后拍照并进行photoshop软件分析等步骤。与现有技术相比，本发明具有灵敏度高、准确性好、检测周期短等优点，可以初步检测某个二化螟种群对Cry1Ac毒素敏感性变异情况，为二化螟抗药性监测、治理和害虫综合防治提供直接的证据。

主权项

一种检测二化螟对Cry1Ac毒素抗药性的方法，该方法包括以下步骤：（1）二化螟中肠刷状缘膜囊泡的提取：收集二化螟幼虫中肠，依次加入匀浆缓冲液、蛋白酶抑制剂和20‑30mM MgCl2溶液，匀浆、离心提取1‑5次，将离心后的沉淀风干，加入溶解缓冲液，得中肠蛋白溶液；（2）双向电泳分离：用蛋白质纯化试剂盒纯化中肠蛋白溶液，纯化后的蛋白溶解于上样缓冲液，离心，上清液加入聚焦盘中，IPG胶条按正负极方向反向置于上清液中，覆盖矿物油，设置等电聚焦程序，在聚焦好的胶条槽内加入平衡缓冲液冲洗胶条，冲洗完毕后进行SDS‑PAGE电泳；（3）酶联免疫反应：SDS‑PAGE电泳结束后，将切下的胶在转膜缓冲液中浸泡20‑60分钟，同时将超厚滤纸、印迹膜浸入转膜缓冲液中浸泡5‑10分钟，按超厚滤纸‑凝胶‑印迹膜‑超厚滤纸的顺序于电转仪上转膜，转膜完成的印迹膜浸入质量浓度为5%的脱脂牛奶溶液中，常温封闭1‑5小时，用PBST缓冲液洗膜，重复3次，然后加入30ml PBST缓冲液、10‑15μl生物素标记的Cry1Ac毒素，常温下反应1‑5小时，用PBST缓冲液洗膜，重复3次，最后再加入30ml PBST缓冲液、5‑10μl 碱性磷酸酶‑生物素抗体，常温下反应1‑5小时，用PBST缓冲液洗膜，重复3次，应用BCIP/NBT显色试剂盒进行显色，拍照得杂交膜显色照片；（4）photoshop软件分析：应用photoshop软件得出杂交膜照片上结合蛋白点的平均灰度值和平均像素值，与敏感品系的二化螟杂交膜显色照片对比，判断待测二化螟是否产生抗药性，其中，步骤（1）所述的匀浆缓冲液中各成分的浓度为：甘露醇250‑350mM、EGTA 5‑10mM、tris‑HCl 15‑20mM、PMSF 1‑2mM，所述匀浆缓冲液和MgCl2溶液的体积用量为二化螟幼虫中肠体积的3‑10倍，所述蛋白酶抑制剂的体积用量为二化螟幼虫中肠体积的0.01‑0.1倍，步骤（1）所述的溶解缓冲液中各成分的浓度为：甘露醇150mM、EGTA 2.5mM、tris‑HCl 8.5mM。