[发明专利]检测二化螟对Cry1Ac毒素抗药性的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和农作物病虫害防治领域，涉及一种检测二化螟对Cry1Ac毒素抗药性的方法，尤其是一种检测二化螟对Cry1Ac毒素抗药性的分子检测方法。

背景技术

苏云金芽孢杆菌产生的Cry毒素是目前转基因作物中应用最为成功的抗虫基因。Cry 毒素毒杀昆虫的机制有两种假说。第一种假说认为：Cry毒素经中肠蛋白酶水解活化，并与中肠特异性受体结合，毒素亚基低聚，在膜上形成孔洞结构，导致细胞膨胀和裂解，进而造成昆虫死亡；另一种假说则认为：毒素的毒性与低聚化无关，毒素与中肠特异性受体蛋白结合后，激活了Mg²⁺依赖的信号通路，干扰细胞骨架和离子通道的稳定性，最终导致细胞死亡。以上两种假说均认为Cry毒素与中肠受体的结合能力是其毒力表现的关键因素。

害虫抗药性分子检测技术是基于对害虫抗药性分子机制了解的基础上建立起来的。前人研究表明，与敏感品系相比，棉铃虫、烟蚜夜蛾等鳞翅目昆虫抗性品系中肠Bt结合蛋白与Bt毒素的结合能力下降（即杂交膜结合位点亮度减弱）。

二化螟Chilo suppressalis是我国水稻上危害最为严重的害虫之一，至今一直依赖化学农药对其进行防治。化学农药的大面积使用不仅带来了害虫抗药性，次要害虫再猖獗等不利现象，而且引起了一系列的食品安全问题。转基因抗虫水稻的成功研制，为二化螟的综合防治提供了经济而有效的途径。虽然目前仍无有关二化螟Bt抗性品系的报导，但随着转基因水稻的推广，使得二化螟在整个生长周期都受到Bt杀虫蛋白的高压选择，存在产生抗性的危险。目前有关二化螟抗药性的监测大都局限于生物测定，生物测定本身的局限性是这种常规的检测方法不能检测早期抗性和低频率抗性等位基因。生物测定方法普遍存在的缺点还有：（1）灵敏度低。生物测定检测早期抗性和低频率抗性等位基因，尤其是抗性等位基因是隐性或不完全隐性；（2）周期长。生物测定结果一般需要24小时以上，对特殊作用方式的杀虫剂需要更长时间，如内吸性杀虫剂、生长调节剂和取食阻断剂等；（3）对试虫要求高。生物测定不但需要大数量的试虫，而且要求试虫生长整齐划一，很难直接由田间获得。在二化螟Bt蛋白快速检测技术想需求日益上升之际，一种分子检测方法显得十分重要，而普通的生物测定检测方法根本不能满足这些要求。

发明内容

本发明的目的是克服现有的生物测定方法的缺陷，提供一种检测二化螟对Cry1Ac毒素抗药性的分子检测方法。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种检测二化螟对Cry1Ac毒素抗药性的方法，该方法包括以下步骤：

（1）二化螟中肠刷状缘膜囊泡的提取：收集二化螟幼虫中肠，依次加入匀浆缓冲液、蛋白酶抑制剂和20-30mM MgCl₂溶液，匀浆、离心提取1-5次，将离心后的沉淀风干，加入溶解缓冲液，得中肠蛋白溶液；

（2）双向电泳分离：利用蛋白质纯化试剂盒纯化中肠蛋白溶液，纯化后的蛋白溶解于上样缓冲液，离心，上清液加入聚焦盘中，IPG胶条按正负极方向反向置于上清液中，覆盖适量矿物油，设置等电聚焦程序，在聚焦好的胶条槽内加入平衡缓冲液冲洗胶条，冲洗完毕后进行SDS-PAGE电泳；

（3）酶联免疫反应：SDS-PAGE电泳结束后，将切下的胶在转膜缓冲液中浸泡20-60分钟，同时将超厚滤纸、印迹膜浸入转膜缓冲液中浸泡5-10分钟，按超厚滤纸-凝胶-印迹膜-超厚滤纸的顺序于电转仪上转膜，转膜完成的印迹膜浸入5%PBST脱脂牛奶中常温封闭1-5小时，用PBST缓冲液洗膜，重复3次，然后加入30ml PBST缓冲液、10-15μl生物素标记的Cry1Ac毒素，常温下反应1-5小时，用PBST缓冲液洗膜，重复3次，最后再加入30ml PBST缓冲液、5-10μl 碱性磷酸酶-生物素抗体，常温下反应1-5小时，用PBST缓冲液洗膜，重复3次，应用BCIP/NBT显色试剂盒进行显色，拍照得杂交膜显色照片；

（4）photoshop软件分析：应用photoshop软件得出杂交膜照片上结合蛋白点的平均灰度值和平均像素值，与敏感品系的二化螟杂交膜显色照片对比，判断待测二化螟品系是否产生抗药性，

其中，步骤（1）所述的匀浆缓冲液中各成分的浓度为：

甘露醇250-350mM、EGTA 5-10mM、tris-HCl 15-20mM、PMSF 1-2mM，

所述匀浆缓冲液和MgCl2溶液的体积用量为二化螟幼虫中肠体积的3-10倍，所述蛋白酶抑制剂的体积用量为二化螟幼虫中肠体积的0.01-0.1倍。