[发明专利]检测二化螟对Cry1Ac毒素抗药性的方法

权利要求书

1.一种检测二化螟对Cry1Ac毒素抗药性的方法，该方法包括以下步骤：

（1）二化螟中肠刷状缘膜囊泡的提取：收集二化螟幼虫中肠，依次加入匀浆缓冲液、蛋白酶抑制剂和20-30mM MgCl₂溶液，匀浆、离心提取1-5次，将离心后的沉淀风干，加入溶解缓冲液，得中肠蛋白溶液；

（2）双向电泳分离：用蛋白质纯化试剂盒纯化中肠蛋白溶液，纯化后的蛋白溶解于上样缓冲液，离心，上清液加入聚焦盘中，IPG胶条按正负极方向反向置于上清液中，覆盖矿物油，设置等电聚焦程序，在聚焦好的胶条槽内加入平衡缓冲液冲洗胶条，冲洗完毕后进行SDS-PAGE电泳；

（3）酶联免疫反应：SDS-PAGE电泳结束后，将切下的胶在转膜缓冲液中浸泡20-60分钟，同时将超厚滤纸、印迹膜浸入转膜缓冲液中浸泡5-10分钟，按超厚滤纸-凝胶-印迹膜-超厚滤纸的顺序于电转仪上转膜，转膜完成的印迹膜浸入质量浓度为5%的脱脂牛奶溶液中，常温封闭1-5小时，用PBST缓冲液洗膜，重复3次，然后加入30ml PBST缓冲液、10-15μl生物素标记的Cry1Ac毒素，常温下反应1-5小时，用PBST缓冲液洗膜，重复3次，最后再加入30ml PBST缓冲液、5-10μl 碱性磷酸酶-生物素抗体，常温下反应1-5小时，用PBST缓冲液洗膜，重复3次，应用BCIP/NBT显色试剂盒进行显色，拍照得杂交膜显色照片；

（4）photoshop软件分析：应用photoshop软件得出杂交膜照片上结合蛋白点的平均灰度值和平均像素值，与敏感品系的二化螟杂交膜显色照片对比，判断待测二化螟是否产生抗药性，

其中，步骤（1）所述的匀浆缓冲液中各成分的浓度为：

甘露醇250-350mM、EGTA 5-10mM、tris-HCl 15-20mM、PMSF 1-2mM，

所述匀浆缓冲液和MgCl₂溶液的体积用量为二化螟幼虫中肠体积的3-10倍，所述蛋白酶抑制剂的体积用量为二化螟幼虫中肠体积的0.01-0.1倍，

步骤（1）所述的溶解缓冲液中各成分的浓度为：

甘露醇150mM、EGTA 2.5mM、tris-HCl 8.5mM。

2.如权利要求1所述的检测二化螟对Cry1Ac毒素抗药性的方法，其中，步骤（1）所述的匀浆缓冲液中各成分的浓度为：

甘露醇300mM、EGTA 5mM、tris-HCl 17mM、PMSF 1mM。

3.如权利要求1或2所述的检测二化螟对Cry1Ac毒素抗药性的方法，其中，所述匀浆缓冲液和MgCl₂溶液的体积用量为二化螟幼虫中肠体积的4.5倍，所述蛋白酶抑制剂的体积用量为二化螟幼虫中肠体积的0.04倍。

4.如权利要求1所述的检测二化螟对Cry1Ac毒素抗药性的方法，其中，步骤（1）中所述的匀浆、离心提取的次数为3次。

5.如权利要求1所述的检测二化螟对Cry1Ac毒素抗药性的方法，其中，步骤（3）中所述的生物素标记的Cry1Ac毒素的加入量为12.5μl，所述的碱性磷酸酶-生物素抗体的加入量为6μl。