[发明专利]重组人胰岛素样生长因子-2蛋白及其生产方法

摘要

本发明公开一种重组人胰岛素样生长因子-2蛋白及其生产方法，表达宿主BL21（DE3），载体pET32-a(+)，步骤如下：克隆hIGF2基因；构建原核表达载体；可溶性的N端带有His×6标记的Trx-hIGF2融合蛋白的表达；Trx-hIGF2融合蛋白的纯化；利用带His×6标记的肠激酶对Trx-hIGF2融合蛋白进行酶切，得高纯度的hIGF2。本发明首次用BL21（DE3）和pET32-a(+)，实现hIGF2高效可溶性融合表达；用His×6标签及肠激酶切割技术，实现在蛋白质一级结构上，与hIGF2完全相同的重组hIGF2蛋白的制备，表达产物也具有生物活性。

主权项

一种Trx‑hIGF2融合蛋白的生产方法，其特征在于，主要包括以下步骤：（1）克隆hIGF2基因：以人肾脏细胞中提取的总mRNA为模板，先用RT‑PCR扩增总cDNA，再以该cDNA为模板，用特异引物扩增出完整hIGF2基因片段，所用hIGF2特异引物中引入BamH I酶切位点和HindIII酶切位点；回收PCR产物连接到质粒pMD20‑T载体，得重组质粒hIGF2/pMD20‑T，经过测序确定为读码框正确的重组载体；（2）构建原核表达载体：将表达载体pET32‑a(+)和步骤（1）所得的重组质粒hIGF2/pMD20‑T经Hind III及BamH I双酶切并纯化回收，并用T4DNA连接酶连接，得重组载体pET32‑a(+)/hIGF2，将重组载体转化到大肠杆菌TOP10菌株中，再从TOP10中提取重组载体pET32‑a(+)/hIGF2；用热激法，将重组载体pET32‑a(+)/hIGF2转入到大肠杆菌表达菌株BL21CodonPlus（DE3）中，经LBAmp抗性平板筛选得到大肠杆菌重组转化子；（3）Trx‑hIGF2融合蛋白的表达：将步骤（2）所得的大肠杆菌重组转化子于37℃培养至OD600为0.55－0.65，加入0.05－1.0mM的IPTG，于温度为20℃的条件下诱导5‑7小时，超声破碎，离心取上清液，得到大量表达的可溶性的N端带有His×6标记的Trx‑hIGF2融合蛋白；（4）Trx‑hIGF2融合蛋白的纯化：利用镍亲合层析法对步骤（3）所得的Trx‑hIGF2融合蛋白进行纯化。