[发明专利]环境水体中人类肠道病毒与非人类肠道病毒含量检测方法

摘要

本发明公开了一种环境水体中人类肠道病毒与非人类肠道病毒的含量检测方法。在已建立环境水体中肠道病毒定量检测方法的基础上，选择针对人类肠道病毒的引物和探针，制备重组质粒作为标准品，建立了定量检测人类肠道病毒的实时荧光定量PCR反应体系，定量检测环境水体中的人类肠道病毒含量和肠道病毒含量，进一步确定非人类肠道病毒的分布情况。该方法具有良好的特异性，灵敏度高，可对人类肠道病毒，肠道病毒进行准确定量并确立环境水体中人类肠道病毒与非人类肠道病毒的关系。

主权项

1.一种环境水体中人类肠道病毒与非人类肠道病毒含量检测方法，其特征在于，方法按下述步骤进行：步骤一，样品处理：（1）样品采集：采集待检测水样后于4℃条件下保存；（2）病毒浓缩：于V mL的待检测水样中加入质量百分比为8%的聚乙二醇（PEG-6000）和质量百分比为2.3%的氯化钠（NaCl）；接着将待检测水样在100rpm、4℃条件下搅拌12小时；然后将待检测水样在9000g，4℃条件下离心30分钟，弃上清液，用1mL超纯水重悬沉淀得到病毒浓缩液，其中50≤V≤250；（3）RNA提取：使用RNA提取试剂盒从病毒浓缩液中提取RNA；（4）逆转录：将5μL的RNA、2μL的5×gDNA Eraser Buffer、1μL的5×gDNA Eraser Buffer和2μL的RNase Free dH₂O在42℃条件下反应2min得到反应液，将该反应液与4μL的Buffer、1μL的RT Enzyme Mix、1μL的RT Primer Mix和4μL的RNase Free dH₂O混合进行如下反应：先在37℃条件下反应15min；接着在85℃条件下反应5s；得到cDNA，并将所得cDNA在-80℃条件下保存；步骤二，标准品制备：（1）第一轮PCR扩增：以步骤一获得的cDNA为模板，利用上游引物EVR-F1和下游引物EVR-R1进行PCR扩增，得到第一轮扩增后的PCR产物，其中：上游引物EVR-F1的核苷酸序列为：5’-CCCCTGAATGCGGCTAATCC-3’；下游引物EVR-R1的核苷酸序列为：5’-CAATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’；（2）第二轮PCR扩增：以第一轮扩增后的PCR产物为模板，利用上游引物EVR-F2和下游引物EVR-R2进行PCR扩增，得到第二轮扩增后的PCR产物，其中：上游引物EVR-F2的核苷酸序列为：5’-GTAACGGGCAACTCTGCAGC-3’；下游引物EVR-R2的核苷酸序列为：5’-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’；（3）将所得的第二轮扩增后的PCR产物电泳胶纯化回收目的片段，得到目的片段产物，该目的片段产物的长度为m（bp）；（4）首先将目的片段产物与pMD19-T载体连接转化至大肠杆菌DH5α中，筛选出转化进插入目的片段的载体的菌落，将该阳性菌在含有卡那霉素的LB液体培养基中于37℃条件下培养12~16小时得到菌液，其中卡那霉素的质量浓度为50μg/mL；然后用质粒提取试剂盒从菌液中提取质粒；接着采用双脱氧终止法对得到的质粒的核苷酸序列进行测定，将所测得的核苷酸序列在NCBI基因库经BLAST比对，当所测得的核苷酸序列与人类肠道病毒基因相似度大于等于90%时，提取的质粒为标准品；当所测得的核酸序列与人类肠道病毒基因相似度小于90%时，重复步骤（4），直至提取的质粒为标准品；（5）检测标准品的OD₂₆₀值n；（6）利用（式1）计算标准品浓度C（copies/μL）：C=n×50×10-9(2962+m)×2×330×6.02×1023]]>（式1）式1中：2962为pMD19-T载体的长度，bp；1OD₂₆₀=50μg/mL的双链DNA；330为1碱基的分子量，g/mol；6.02×10²³为阿伏伽德罗常数，NA；（7）配制c×10^-4copies/μL、c×10^-5copies/μL、c×10^-6copies/μL、c×10^-7copies/μL、c×10^-8copies/μL、c×10^-9copies/μL和c×10^-10copies/μL七个浓度梯度的标准品溶液样品，利用实时荧光定量PCR分别检测各浓度梯度样品的Ct值和初始模版量x（copies），接着利用测得的七组Ct-x进行线性回归分析，得到标准曲线方程：Ct＝alogx+b   （式2）式2中：a和b为标准曲线方程的系数；步骤三，定量检测：（1）将10μL的2×Premix EX Taq^TM Mix、200nM的上游引物EVR-F2、200nM的下游引物EVR-R2、400nM的TaqMan探针EVR-P、0.4μL的50×ROXReference DyeⅡ和2μL步骤一所获得的cDNA混合，接着用无菌超纯水补足至20μL，在实时定量PCR仪上进行扩增，检测步骤一所获得的cDNA的Ct值Ct₀，同时以无菌超纯水作为阴性对照；其中的PCR反应条件为：①95℃预变性2min；②扩增循环45次：95℃，15s；60℃，60s；所述TaqMan探针EVR-P的核苷酸序列为：5'-6-FAM-CACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTCC-BHQ1；（2）将Ct₀代入（式2）计算待检测水样的初始模板量x₀，待检测水样中人类肠道病毒的含量C_HEV（copies/mL）为：CHEV=x0(20/2)(60/5)(1000/140)V]]>（式3）（3）根据环境水体中肠道病毒的定量检测方法检测待检测水样中肠道病毒的含量C_EV（copies/mL）；（4）待检测水样中非人类肠道病毒含量C_M（copies/mL）为：C_M＝C_EV-C_HEV（式4）。