[发明专利]一种组织工程角膜的制备方法及其装置

摘要

一种组织工程角膜的制备方法及其装置，本发明是在脱细胞角膜基质上接种羊膜上皮细胞，经培养得到复合羊膜上皮细胞的构建体；再以双面培养方式，采用气液交替光照培养与液下无光照培养进行交替培养完成。所制备的组织工程角膜是一种优良的角膜替代物，具有接近天然角膜的热稳定性和透明度，在680nm波长下，透光率为90％～95％；由于采用双面培养装置，能使构建体表面充分接触气体，增加上皮细胞膜片的复层层数，达到5～7层细胞堆积，并使存活率大于90％，维持着良好的干细胞性；可用于角膜溃疡、角膜白斑、角膜营养不良等各类型角膜板层移植，尤其在伴有持续性上皮缺损、角膜缘干细胞缺乏的高危移植中能显现出很好的临床疗效。

主权项

一种组织工程角膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、接种羊膜上皮细胞：将哺乳动物源性的脱细胞角膜基质置于细胞培养皿中，将羊膜上皮细胞按1×105～1×106个/cm2的密度接种于脱细胞角膜基质的前弹力层表面；加入培养液A，于37℃条件下，在体积浓度分别为85％～93％的N2、5％的CO2和2％～10％的O2环境中培养5～7天；每两天换液，待羊膜上皮细胞于前弹力层表面生长汇合，得到复合羊膜上皮细胞的构建体；所述培养液A是以浓度为17.6g/L的MCDB153培养基水溶液为基液，内含有：表皮生长因子2μg/L、人胰岛素10mg/L、L‑谷氨酰胺2mM、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸钠1.18g/L、花生四烯酸2mg/L、腺嘌呤10mg/L、三碘甲状腺氨酸20ng/L、亚硒酸钠5mg/L和转铁蛋白100mg/L；步骤二、气液交替培养上皮细胞膜片：将步骤一所得构建体的基质面与培养液A接触培养；将羊膜上皮细胞面与培养液B间歇性接触培养，即用培养液B培养10s后再暴露于空气20s，如此反复循环12h；培养过程在光照条件下，37℃、体积浓度5％的CO2环境中进行；其中培养液B的组成是在纯水中含：2～10μg/L的EGF，100～300ng/L转化生长因子α，2～13μg/L转化生长因子β1，10～30μg/L维生素A，100～300mg/L维生素C，45μM酪氨酸，100～200μM谷胱甘肽，20～100mg/L葡萄糖，1～2mM氯化钙，10～25g/L硫酸软骨素，1～10g/L透明质酸，pH 7.2～7.4，渗透压280～320mOsm/kg；步骤三、角膜结构成熟培养：分别更换步骤二中的培养液A和培养液B，将步骤二所得构建体的基质面与培养液A接触，将羊膜上皮细胞面与培养液B接触，液下培养12h；培养过程在37℃、无光照条件下，体积浓度分别为 85％～93％的N2、5％的CO2和2％～10％的O2的混合气体环境中进行；将步骤二与步骤三交替进行，每12小时交替一次，培养持续10～15天，最终得到结构进一步成熟的组织工程角膜。