[发明专利]一种单端孢霉烯B族毒素的合成方法

摘要

本发明属于生物毒素合成技术领域，与生物发酵技术领域有关。本发明以大米颗粒为原料，经接种镰刀菌复苏、产分生孢子、分生孢子接种大米产毒培养基培养，培养基甲醇液提取、饱和、萃取、柱层析、水解和结晶等工艺过程，制备出一种单端孢酶类毒素-3Ac-DON和DON毒素结晶。一次结晶后毒素经核磁和质谱结构鉴定准确无误，含量不低于94%。传统提取工艺相比，本发明的一步法柱层析即可分离纯化出3Ac-DON毒素，步骤简单快捷产量高，制备的毒素性质稳定纯度高，显著降低了毒素合成成本，合成的3Ac-DON毒素经一步水解可得到DON，整个过程操作避免了色素干扰，简单，省时省力。得到的两种毒素均可以广泛应用于毒理学、代谢实验等各种毒素领域。

主权项

一种单端孢霉烯B族毒素特别是三乙酰基脱氧血腐镰刀菌烯醇毒素（3Ac‑DON）和脱氧血腐镰刀菌烯醇毒素（DON）的生物合成方法，其特征在于，通过控制温度培养，在产毒高峰期进行萃取和柱层析分离得3Ac‑DON毒素，将所得3Ac‑DON毒素进一步经碱水解得到DON毒素；其中：3Ac‑DON毒素制备步骤如下所述：（1）菌种复苏、孢子液制备及大米接种培养菌种复苏：生产菌种为禾谷镰刀菌Fusarium graminearum DSM No.4528，将该菌的菌粉在无菌蒸馏水下室温复水一夜后，接种至马铃薯葡萄糖琼脂培养基，在10‑30℃下培养4‑10天；分生孢子液制备：取培养4‑10天的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，挑取菌丝至分生孢子培养基，在光照强度为1000lux，15‑30℃，200rpm摇床培养3‑5天；大米接种培养：将摇床培养3‑5天后的分生孢子液，接种到在121℃高压蒸汽下每次灭菌30分钟，每天一次和灭菌两天后的大米产毒培养基中，接种后置于28℃黑暗下培养7‑9天；（2）大米培养物3Ac‑DON毒素的提取分离，其步骤包括：固液萃取：向培养后的大米培养基中加入2‑3倍体积的甲醇水溶液，并搅拌均匀，浸泡静置3天；液液萃取：将浸泡3天后的甲醇液抽滤，收集甲醇液，旋转蒸发去除甲醇相，收集蒸去甲醇相后的浑浊水相采用氯化钠饱和过夜，滤去不溶沉淀，将过滤后的水相加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液蒸干，收集所得3Ac‑DON粗毒素；柱层析：用少量乙酸乙酯溶解上步粗毒素后上样，用石油醚丙酮洗脱，每隔30mL收集，以DON毒素化学标准品为对照，收集含有3Ac‑DON毒素单一染色点部分，旋转蒸干；结晶：将蒸干后的3Ac‑DON毒素单一部分采用少量石油醚丙酮溶解，放入4℃冰箱，静置过夜，待白色晶析出，收集放入真空干燥器干燥，即获得纯度不低于95%的3Ac‑DON毒素结晶；所述的DON毒素制备方法是：将步骤（2）所得的3Ac‑DON毒素进行碱水解，其步骤包括：碱水解：将3Ac‑DON晶体溶解于甲醇中，向其中逐滴滴加0.5mol/L NaOH，并用薄层色谱监测反应过程，待3Ac‑DON完全水解后停止，用1mol/L柠檬酸调至中性；结晶：将反应液旋转蒸干，加入少量蒸馏水稀释，用乙酸乙酯萃取3次，DON即在乙酸乙酯层；将蒸干后的DON毒素单一部分采用少量乙酸乙酯溶解，放入4℃冰箱，静置过夜，待白色晶析出，收集放入真空干燥器干燥，干燥条件为真空度‑0.1MPa，40℃,24‑48h，即获得含量≥92.58%的DON毒素结晶。