[发明专利]一种制备人血清白蛋白-人甲状旁腺激素的方法

摘要

本发明提供一种制备人血清白蛋白-人甲状旁腺激素的方法。通过对酵母宿主SMD1168进行改造，敲除SMD1168基因组上yapsin1的编码序列。本发明在SMD1168的基础上进一步将yapsin1的编码基因YPS1敲除即实现了蛋白酶A和yapsin1的双重敲除，将该改造宿主命名为SMD1168yps1△。再利用上述改造宿主来优化重组表达人血清白蛋白-人甲状旁腺激素（1-34）融合蛋白，从而减少表达过程中的目的蛋白的降解，降低下游大规模生产成本以及分离纯化难度，。本发明提供的优化人血清白蛋白-甲状旁腺激素（1-34）融合蛋白可在制备治疗骨质疏松的PTH（1-34）药物中的应用。

主权项

一种制备人血清白蛋白‑人甲状旁腺激素的方法，通过以下步骤实现：（a）设计YPS1的5’端同源臂以及3’端同源臂扩增引物，并从毕赤酵母基因组中有效扩增出这两个同源臂序列；其中用于扩增YPS1 5’端同源臂序列的上游引物序列SEQ ID NO.1：5’‑aagcctgcag agctccattg cgccaacccc‑3’，划线部分为PstⅠ酶切位点，下游引物序列SEQ ID NO.2：5’‑cggcgtcgac aatctggctg agcggaaagt ttga‑3’，划线部分为SalⅠ酶切位点，用于扩增YPS1 3’端同源臂序列的上游引物序列SEQ ID NO.3：5’‑cccagatctc acatttcgcg cctgccttcc t‑3’， 划线部分为BglⅡ酶切位点，下游引物序列SEQ ID NO.4：5’‑aaactgcagg ggtgagcctg tctggccct‑3’，划线部分为PstⅠ酶切位点；（b）将步骤（a）中得到的这两个同源臂序列按照先后顺序插入到载体pPICZαB中，获得用于后续同源重组的重组载体pPICZαB‑YPS1△，序列为SEQ ID NO.12；（c）将步骤（b）中构建的重组载体用单一限制性内切酶酶切后转染SMD1168，用含有Zeocin的选择压力的培养筛选重组子，用相应的阳性引物和阴性引物验证同源重组的正确性，正确的缺陷型重组子记为SMD1168 yps1△；其中阴性引物序列为：5’‑ctc ctt cca ccg cca cgg c‑3’，5’‑ acc act tga ggc gtc ctt gga‑3’，阳性引物序列为SEQ ID NO.7：5’‑ atg gag gag ttg agg acc ‑3’，5’‑ gca aat ggc att ctg aca tcc‑3’；（d）利用步骤（c）中得到的蛋白酶缺陷型宿主SMD1168 yps1△表达相应的蛋白水解酶敏感型重组蛋白—人血清白蛋白‑人甲状旁腺激素1‑34融合蛋白，SEQ ID NO:13为该融合蛋白的基因和蛋白质序列。