[发明专利]基于溶血素基因的病原鳗利斯顿氏菌的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法

摘要

本发明是一种基于溶血素基因的病原鳗利斯顿氏菌的SYBRGreenⅠ实时定量PCR检测方法，该方法包括特异性引物设计、标准质粒的构建、SYBRGreenⅠ实时定量PCR的反应体系、SYBRGreenⅠ实时定量PCR的反应程序、标准曲线的建立和样品检测，在对样品进行检测时,根据其Ct值和线性方程获得该样品DNA拷贝数；本发明采用SYBRGreenI荧光定量PCR技术，对发病水产动物及养殖用水的病原鳗利斯顿氏菌进行定量检测，简便快速、特异性好、灵敏度高，且价格低廉。它解决了以往检测病原鳗利斯顿氏菌的方法繁琐，检测时间长，检测费用高的问题，并且可以即时、准确的提供数据用于生产和科学研究。

主权项

1.一种基于溶血素基因的病原鳗利斯顿氏菌的SYBRGreenⅠ实时定量PCR检测方法,其特征在于，其步骤如下：（1）特异性引物设计：从GenBank上获得鳗利斯顿氏菌及其他弧菌的溶血素基因的DNA序列，采用DNAStar软件进行同源性分析,确定在鳗利斯顿氏菌菌株内保守、其他弧菌间特异的片段,利用生物软件Primer5.0对该保守片段设计鳗利斯顿氏菌的特异性检测引物为：va-hly-F为5'-TGCGCTATATTGTCGATTTCAGTT-3'；va-hly-R为5'-GCACCCGTTGTATCATCATCTAAG-3'；（2）标准质粒的构建：首先扩增病原鳗利斯顿氏菌BH1（ListonellaanguillarumBH1）溶血素基因，PCR反应条件为：94℃预变性3min，接94℃变性1min、58℃复性1min、72℃延伸1min、30个循环，然后72℃温育7min；在60μL反应体系中含有：双蒸水13.4μL，10×PCR缓冲液2μL，25mMMgCl₂1.6μL，4×dNTP混合物0.4μL，引物各0.2μL，5U/μLTaqDNA聚合酶0.2μL，模板DNA2μL；PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后用柱式DNA胶回收试剂盒将阳性PCR产物进行胶回收、纯化，将回收纯化的溶血素基因的PCR产物，利用PMD18T载体进行连接，连接完毕后将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行蓝白斑筛选，随机挑取6个白色克隆进行菌液PCR鉴定，以确证为阳性克隆；取2个阳性克隆用柱式质粒小量抽提试剂盒提取质粒；用核酸蛋白分析仪测量质粒浓度，根据阿佛加德罗常数换算出每μL质粒中的DNA的拷贝数，作为标准阳性样本；（3）SYBRGreenⅠ实时定量PCR的反应体系：20μL反应体系包括：双蒸水8.6μL，SYBRGreenⅠHotstarFluo-PCRmix10μL，正反向引物各0.2μL，1μL标准阳性质粒或待测样本；（4）SYBRGreenⅠ实时定量PCR的反应程序：94℃4min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，进行45个循环；PCR完成后，利用Bio-RadiQ5OpticalSystemSoftware软件进行数据分析，包括查看扩增曲线、Ct值、熔解曲线、Tm值；（5）标准曲线的建立：鳗利斯顿氏菌PMD18-溶血素基因重组质粒按10倍稀释法稀释成3.0×10⁸～3.0×10¹，共8个浓度梯度，按上述SYBRGreenⅠ实时定量PCR的反应体系和反应程序在实时荧光定量PCR仪上进行扩增；反应结束后，根据得到的各个浓度梯度的循环阈值Ｃt采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线；得出细菌拷贝数与Ct值的线性方程为:Ct=2.086Logconcentration+25.306在对样品进行检测时,根据其Ct值和线性方程获得该样品DNA拷贝数；（6）样品检测：取被检鱼肝脏或肌肉组织，进行研磨后用水煮法提取模板DNA；按上述SYBRGreenⅠ实时定量PCR的反应体系和反应程序在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用去离子水，阳性对照采用鳗利斯顿氏菌PMD18-溶血素基因重组标准质粒的DNA；反应结束后，将DNA样本的循环阈值Ｃt与标准曲线对照，得到DNA样本中的溶血素基因片段拷贝浓度，据此得到被检鱼肝脏或肌肉组织中鳗利斯顿氏菌的DNA拷贝浓度。