[发明专利]一种针对整合酶核心区去整合反应的整合酶抑制剂体外筛选方法

摘要

本发明公开了一种针对整合酶核心区去整合反应的HIV-1整合酶抑制剂体外筛选方法，经过整合酶核心区蛋白的制备、去整合DNA底物的制备、待测化合物样品的制备、待测化合物样品的筛选。本发明较之于现有方法，摒弃了放射性同位素，无环境污染；不需要包被和封闭微孔板等耗时耗力的工作；不需要对产物进行变性和后续标记检测；能够实现高通量和对反应实时检测。达到了简化步骤、缩短时间、降低成本等目的。现有方法中放射自显影方法需10小时以上，固相和液相ELISA也需要3小时左右，而本发明方法所需时间短至1小时以内，同时大大降低了筛选成本。

主权项

1.一种针对整合酶核心区去整合反应的HIV-1整合酶抑制剂体外筛选方法，包括以下步骤：(1)整合酶核心区蛋白的制备：表达纯化野生型整合酶核心区蛋白，定量后稀释为3600nmol/L，分装保存待用。(2)去整合DNA底物的制备：将合成的寡核苷酸链1、2、3、4分别按照等摩尔浓度比例混合，震荡混匀后用铝箔纸完全封闭避光，置于95℃下孵育5分钟变性，缓慢冷却至室温退火，稀释为750nmol/L，分装避光保存待用；所述寡核苷酸序列如下：寡核苷酸链1：5’-CCTCGAAGTCGACCTGCAGCCCAAGCTTGCGTTGCTGAACGAGG-3’寡核苷酸链2：5’-ATGTGGAAAATCTCTAGCAGGCTGCAGGTCGAC-3’寡核苷酸链3：5’-ACTGCTAGAGGATTTTCCACAT-3’寡核苷酸链4：5’-CAGCAACGCAAGCTTG-3’；(3)待测化合物样品的制备：室温下将待测化合物样品用二甲亚砜配制成不同浓度的溶液，充分振荡溶解后备用；(4)待测化合物样品的筛选：反应体系为50μl/微孔，加入去离子水40μl。微孔板设阴性对照3孔，每孔分别加入2μl二甲亚砜，其他孔中每孔分别加入2μl不同浓度的待测化合物样品，设阳性对照3孔，加入的5μl蛋白质样品为高温变性后的整合酶核心区蛋白，之后所有孔均分别加入5μl整合酶核心区蛋白，振荡器充分混匀后，在25℃下孵育10～30分钟，加入去整合DNA底物3μl，振荡器充分混匀后，在37℃下孵育30分钟，用荧光分析仪检测报告基团信号，按照以下公式计算待测样品的抑制率：计算待测样品的抑制率。