[发明专利]一种针对整合酶核心区去整合反应的整合酶抑制剂体外筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说是涉及一种针对整合酶核心区去整合反应的整合酶抑制剂体外筛选方法。

背景技术

整合酶是HIV-1病毒编码的一种蛋白质，在体内通过催化3’加工和链转移两步反应，介导病毒DNA和宿主细胞基因组的整合，其中，链转移反应是整合酶催化的关键反应。研究表明，在体外，应用纯化的重组整合酶蛋白、分别模拟病毒和宿主细胞DNA的寡核苷酸链，能够实现整合过程。据此，可以开展整合酶抑制剂的体外筛选，目前，已经成功筛选获得了整合酶抑制剂，且第一个针对整合酶的抗艾滋病药物raltegravir已经于2007年获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市。整合酶在体外还能够催化整合过程的逆反应，即去整合反应，将整合形成的DNA复合物(整合中间体)还原重新生成病毒DNA和宿主细胞DNA两部分，整合酶的关键结构域——整合酶核心区，具有独立催化去整合反应的活性。目前，针对HIV-1整合酶核心区去整合反应的整合酶抑制剂体外筛选方法主要有以下几类：

1、使用放射性同位素标记DNA底物的凝胶电泳和放射自显影方法

Chow等人(Chow SA，Vincent KA，Ellison V，Brown PO.Reversal of integration and DNA splicing mediated by integrase of human immunodeficiency virus.Science，1992，255(5045)：723-726.)报道了根据放射性同位素标记DNA底物的放射自显影方法筛选去整合抑制剂。该方法根据整合反应中病毒DNA与宿主DNA核苷酸序列，合成4条寡核苷酸链，在其中一条链的末端标记放射性同位素32P，寡核苷酸链混合后，变性退火形成Y型的去整合DNA底物，模拟链转移反应形成的整合中间体。去整合反应将整合酶中间体还原为病毒DNA链和宿主细胞DNA链，反应产物经变性凝胶电泳后，可以通过放射自显影观察到，根据反应产物片段在凝胶中的片段大小和位置可以对产物和反应程度定量分析，加入抑制剂后，可通过设置各种对照，计算抑制剂的抑制效果。基于放射性同位素标记DNA底物的凝胶电泳和放射自显影方法具有结果直观可靠等优点，被称为黄金标准。该方法主要存在通量低、时间长、操作繁琐、需特殊设备和专业操作人员，易造成放射性污染等缺点。

2、基于酶联免疫吸附测定法(ELISA)的固相微孔板方法

Gao等人(Gao K，Wang S，Bushman FD.Metal binding by the D，DX35E motif of human immunodeficiency virus type 1integrase：selective rescue of Cys substitutions by Mn²⁺in vitro.Journal of Virology，2004，78(13)：6715-6722.)报道了基于ELISA的固相微孔板方法。使用链霉亲和素包被的微孔板，设计的模拟整合中间体的DNA底物两端分别使用生物素和地高辛标记，通过生物素-链霉亲和素特异性反应将DNA底物固定在微孔板中，去整合反应还原生成宿主DNA时将标记生物素的链合标记地高辛的链共价连接。反应后通过碱变性即随后的ELISA检测手段，能定量分析反应。通过抑制剂对反应影响情况筛选去整合抑制剂。该方法操作相对简单，能实现高通量，但包被和封闭微孔板耗时耗力，且封闭易实效造成高背景信号及低灵敏度。

3、基于磁珠吸附DNA技术和ELISA的液相微孔板方法

He等人(He HQ，Liu B，Zhang XY，Chen WZ，Wang CX.Development of a high-throughput assay for the HIV-1integrase disintegration reaction.Science China Life Sciences，2010，53(2)：241-247.)报道了基于磁珠吸附DNA技术结合ELISA的液相微孔板方法。该方法在基于ELISA的固相微孔板方法的基础上，使用同样的生物素和地高辛标记的DNA底物，引入链霉亲和素磁珠捕获生物素DNA底物，再通过ELISA检测地高辛，据此分析去整合反应并开展整合酶抑制剂筛选。该方法具有固相微孔板方法高通量的优点，且背景信号低，灵敏度特异性高。但是无论固相和液相微孔板方法还是放射自显影方法，均需要反应完全完成后进行后续操作检测，步骤繁琐，检测时间长。

发明内容