[发明专利]具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法

摘要

具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，涉及可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法。方法：酶切pcDNA3.1(-)；酶切pFastBac1；二者连接得pFastBac1-pcDNA3.1(-)；pEGFP-C3进行扩增，产物经纯化后于T-Vector连接得pMD-EGFP；pFastBac1-pcDNA3.1(-)和pMD-EGFP分别酶切，再连接，得pFastBac1-pcDNA3.1(-)-EGFP；制Bacmid-EGFP；转染sf9细胞，得CN-EGFP即完成。本发明首次利用杆状病毒表达载体系统在OL细胞中导入并表达外源基因，拓宽了杆状病毒可转导的哺乳动物细胞范围。

主权项

具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，按以下步骤进行：一、用限制性内切酶Nru I和BstZ17I对质粒pcDNA3.1(‑)进行双酶切；二、用限制性内切酶SnaB I和Hpa I对质粒pFastBac1进行双酶切；三、将双酶切后的质粒pcDNA3.1(‑)和质粒pFastBac1进行平末端连接，连接产物经鉴定后获得重组转移载体pFastBac1‑pcDNA3.1(‑)；四、以pEGFP‑C3为模板，pEGFP‑u和pEGFP‑d为引物进行PCR扩增，PCR产物经纯化后于T‑Vector进行连接，获得pMD‑EGFP；五、用Kpn I和Xho I对重组转移载体pFastBac1‑pcDNA3.1(‑)和pMD‑EGFP分别进行双酶切，分别回收pFastBac1‑pcDNA3.1(‑)重组转移载体和EGFP基因的目的条带，并分别进行纯化，然后纯化产物pFastBac1‑pcDNA3.1(‑)与纯化产物EGFP进行连接，获得pFastBac1‑pcDNA3.1(‑)‑EGFP；六、pFastBac1‑pcDNA3.1(‑)‑EGFP转化DH10Bac细胞并筛选白色单菌落，然后提取重组Bacmid DNA，然后以100ng重组Bacmid DNA为模板，以pEGFP‑u和pEGFP‑d为引物进行PCR扩增，将含有EGFP基因的重组Bacmid命名重组Bacmid‑EGFP；七、利用脂质体介导转染法将重组Bacmid‑EGFP转染sf9细胞，获得重组杆状病毒CN‑EGFP，即完成具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建；其中步骤四和步骤六中引物pEGFP‑u序列均为5′‑CTACTCGAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG‑3′；引物pEGFP‑d序列均为5′‑AGCGGTACCTCAATCTGAGTACTTGTACAGC‑3′。