[发明专利]一种DF1细胞培养外源性禽白血病病毒的快速检测方法

摘要

本发明涉及一种DF1细胞培养外源性禽白血病病毒的快速检测方法，是利用ALV首先要感染DF1细胞，然后再释放至细胞上清，同一培养时间的DF1细胞比细胞上清中的ALV含量高这一原理，通过冻融接种鸡抗凝血的DF1细胞，使DF1细胞中的ALV释放，从而缩短检测到ALV的时间，达到快速检测ALV的目的。与检测细胞培养上清中ALV的常规检测方法比较，本发明不仅具有同等稳定性和准确性，而且更快速，操作流程缩短了4天以上，有利于种鸡场外源性禽白血病净化所必需的批量样品细胞培养检测技术的推广应用。

主权项

一种DF1细胞培养外源性禽白血病病毒的快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：1）DF1细胞的培养DF1细胞传代于24孔细胞培养板，并置于39℃、5%CO2培养箱中进行培养，培养至DF1细胞长成70%‑80%单层；培养基为含10%胎牛血清的高糖细胞培养基DMEM；2） 鸡抗凝血的采集与处理常规方法无菌采集鸡抗凝血1ml，1500rpm离心5min取白细胞，接种到步骤１培养至长成70%‑80%单层的DF1细胞；再向24孔细胞培养板中每孔中加入100μl待检样品，置于39℃、5%CO2培养箱中继续培养2 h，然后换成含1%胎牛血清的高糖细胞培养基DMEM，再置于39℃、5%CO2培养箱中培养；3）DF1细胞的收集培养4d‑5d后倒掉上述细胞培养基， 24孔细胞培养板中每孔加入500μl pH 7.2的磷酸盐缓冲液PBS：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 10mmol/L， KH2PO4 2mmol/L，‑20℃冻存至少1h；4）DF1细胞中p27抗原的检测取出上述冻存的DF1细胞，融化后以3000rpm离心5min后取上层液体，吸取100μl上层液体加到p27抗原反应板中，按ELISA试剂盒说明书检测DF1细胞中的p27抗原，并通过酶标仪读数进行结果判定；当样品与阳性对照比值S/P值大于0.2时，即判定该样品阳性。