[发明专利]一种DF1细胞培养外源性禽白血病病毒的快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种DF1细胞培养外源性禽白血病病毒的快速检测方法，属于生物技术领域。 

背景技术

禽白血病病毒（Avain leukosis virus, 以下简称ALV）是以引起禽各种造血细胞肿瘤性增生为特征的一类反转录病毒群，能感染鸡的可分为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ和Ｊ等６个亚型，其中Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ和Ｊ亚型属于外源性ALV，临床上常见Ａ 和Ｊ亚型，Ｂ、Ｃ、Ｄ亚型相对少见，Ｅ亚型属于内源性ALV，本身不具有致病特征。近几年，外源性ALV尤其是ALV-J已在我国的蛋鸡和地方品种鸡中广泛传播，造成了巨大的经济损失。并且宿主范围的扩大、ALV本身的变异以及与其他病毒的混合感染等都给禽白血病的防制提出了新的挑战。由于目前没有商业化疫苗可用，只能从源头上阻断病毒的传播，因此，必须加强外源性ALV检测方法的研究，及时检测并淘汰感染或者疑似感染鸡，才能有效控制外源性ALV。 

我国每年需要对进口的约120万套种鸡中0.5%-1%个体进行病原学抽样检测，保证进口种鸡的洁净度；并对全国10-15个市场占有量最大的自繁自养种鸡场的核心群开展彻底的净化程序（每个鸡场每年需病原学检测1-1.5万只鸡，每代鸡2-3次），至少持续4-5年；同时，特别需要对农业部国家地方鸡种基因库禽白血病的净化，每个品种核心群至少500只，该基因库现保存有31个我国重要的纯地方品种鸡，承担国家的保种任务。但目前，用于批量血液或蛋清样品病毒感染状态的检测方法技术难度大，检测周期长，大多数实验室达不到这一技术要求，通常在培养7天时开始细胞脱落，导致检测结果不稳定。现有的外源性ALV检测的常规方法是：必须在将血浆或蛋清样品接种鸡胚成纤维细胞系DF1细胞（以下简称DF1细胞），持续培养9天后，取细胞上清用ALV p27抗原ELISA检测试剂盒检测。 

如能既确保ALV-p27抗原检测的灵敏度与稳定性，又能快速检测出p27抗原，即使将常规检测方法所用时间提前1-2天，也将节省大量成本，大幅度提高经济效益，从而有利于将细胞培养法用于种鸡场禽白血病净化所必需的批量样品检测技术的推广应用。 

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服上述不足之处，提供了一种DF1细胞培养外源性禽白血病病毒的快速检测方法，4 -5天即可快速、准确、特异检出鸡抗凝血中外源性ALV。 

ALV在细胞上的复制过程是：鸡抗凝血中ALV首先要吸附细胞，然后通过进入、复制、装配，最终释放子代病毒。本发明是利用ALV首先要感染DF1细胞，然后再释放至细胞上清，同一培养时间的DF1细胞比细胞上清中的ALV含量高这一原理，通过冻融接种鸡抗凝血的DF1细胞，使DF1细胞中的ALV释放，从而缩短检测到ALV的时间，达到快速检测ALV的目的。 

一种DF1细胞培养外源性禽白血病病毒的快速检测方法，包括以下步骤： 

1. DF1细胞的准备

DF1细胞传代于24孔细胞培养板，并置于39℃、5%CO₂培养箱中进行培养，培养至DF1细胞长成70%-80%单层；培养基为含10%胎牛血清的高糖细胞培养基（DMEM）。

2. 鸡抗凝血的采集与处理 

常规方法无菌采集鸡抗凝血1ml，1500rpm离心5min取白细胞，接种到步骤１培养至长成70%-80%单层的DF1细胞；再向24孔细胞培养板中每孔加入100μl待检样品，置于39℃、5%CO₂培养箱中继续培养2 h，然后换成含1%胎牛血清的高糖细胞培养基（DMEM），再置于39℃、5%CO₂培养箱中培养。

3. DF1细胞的收集 

培养4d-5d后倒掉上述细胞培养基， 24孔细胞培养板中每孔加入pH 7.2的磷酸盐缓冲液（PBS，NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 10mmol/L， KH₂PO₄ 2mmol/L）500μl，-20℃冻存，至少1h以上。

4. DF1细胞中p27抗原的检测 

取出上述冻存的DF1细胞，融化后以3000rpm离心5min后取上层液体，吸取100μl上层液体加到p27抗原反应板中，按ELISA试剂盒说明书检测DF1细胞中的p27抗原，并通过酶标仪读数进行结果判定。当样品与阳性对照比值（S/P值）大于0.2时，即判定该样品阳性。

ALV p27抗原检测用ELISA试剂盒由IDEXX公司生产。