[发明专利]一种转基因鱼纯合子的快速鉴定方法及应用

摘要

本发明公开了一种转基因鱼纯合子的快速鉴定方法及应用，其步骤：A：剪取约0.5-1cm2的转基因鱼尾鳍组织，提取DNA；B：采用常规PCR技术检测转植基因阳性；C：采用SYBRGreenreal-timePCR的2−△△Ct方法分析转植基因为阳性的转基因鱼的基因型，比较纯合子和半合子转基因鱼中转植基因整合的相对拷贝数，鉴定和筛选出转基因纯合子，并通过测交试验进一步确证。本发明方法易行，快速准确，操作简便。鉴定和筛选的转基因鱼纯合子对于建立转基因鱼纯系，加快转基因鱼新品种培育进程具有重要意义。

主权项

一种转基因鱼纯合子的快速鉴定方法，其步骤是：A、DNA提取：剪取0.5‑1cm2的转GH基因鱼尾鳍组织，按血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒操作指南，提取转GH基因鱼基因组DNA；B、阳性转GH基因鱼鉴定：采用常规PCR技术鉴定阳性转GH基因鱼，PCR体系总体积为25ul，包括20ng DNA，0.5μl dNTP，2.5ul缓冲液，2.5ul MgCl2，1Unit T.Aquaticus DNA聚合酶，引物各1μl；上下游引物序列分别为：F：5′‑CATTTACAGTTCAGCCATGGCTAGA‑3′和R：5′‑AGCACCACCGACAACAGCACTAATG‑3′，反应程序：94℃预变性5min，扩增30个循环：94℃，30s；58℃，30s；72℃，30s，最后72℃延伸5min，取反应产物5ul置于1％g/ml琼脂糖凝胶电泳，预期扩增的转植基因片段大小为323bp；C、纯合子鉴定与筛选：转植基因gcGH在纯合子转基因鱼基因组中的拷贝数是其在半合子转基因鱼基因组中拷贝数的2倍，通过Real‑time PCR分析转基因鱼中转植基因gcGH的基因型来鉴别转基因鱼纯合子和半合子：在黄河鲤鱼基因组中拷贝数恒定不变的GnRH‑III基因为内参基因，以转植的gcGH为目标基因，进行实时定量PCR；取20ngDNA，50mM dNTP，10ul SYBR Green Mix通过荧光定量PCR对gcGH和GnRH‑III基因进行分析，实验采用ABI PRISM 7000定量PCR仪，反应条件为95℃，2min，95℃，15s，60℃，30s，72℃，45s，40个循环，20ul反应体系包括SYBR Green Mix PCR10ul，20‑50ng纯化DNA，上下游引物各2ul，gcGH基因上下游引物分别为F：5’‑TGTCTGGCACATCTGAGG‑3’，R：5’‑GAAAGCATCATATCCATACC‑3’所扩增的片段全长为205bp，GnRHIII基因上下游引物分别为F：5’‑ATGGAGTGGAACGGAAGGT‑3’，R：5’‑CAGACAAATGAGAACAAGAGGAA‑3’，所扩增的片段全长为169bp；D、纯合子验证：将步骤C筛选出的纯合子转基因黄河鲤鱼与对照黄河鲤鱼杂交后，按步骤A和B所示方法鉴定杂交子代的阳性率，根据孟德尔遗传定律，纯合子转基因鱼与对照鱼杂交子代的阳性率为100％，半合子转基因鱼与对照鱼杂交子代的阳性率为50％。