[发明专利]一种从绵羊毛囊组织中提取总RNA的方法

摘要

本发明属于RNA制备技术领域，具体涉及一种从绵羊毛囊组织提取总RNA的方法。其特征包括，从野外现场采集绵羊毛囊，样品低温运输、保存和RNA提取步骤得到毛囊总RNA。本发明提取毛囊总RNA，不会被外源或内源RNA酶降解到最低限度，能最大限度地保持被提取的总RNA的纯度，以利于后续试验的利用。本发明操作简单方便，成本低，无需液氮和RNA样品保护液。本发明获得的毛囊组织总RNA纯度高、完整度好，可用于反转录cDNA、PCR、QPCR等下游操作及mRNA与microRNA的检测应用。

主权项

一种从绵羊毛囊组织中提取总RNA的方法，其特征在于以下步骤：(1)现场采集：a)取绵羊毛囊至装有700μL TRIzol的1.5mL锥形底离心管中，毛囊组织的收集量至毛囊组织总体积占TRIzol液体体积的1/3；b)立刻用小型塑料研磨杵在离心管内研磨1min，向离心管内补充300μL TRIzol使1.5mL离心管内的TRIzol总量达1mL；盖好盖子甩动离心管让毛囊完全浸泡在TRIzol液体中，将离心管放入离心管盒内，即完成采集；c)在避光条件下，于24小时内将研磨后装有样品的离心管放入‑20℃暂时冻存；(2)样品运输：将装有样品的离心管从‑20℃取出放入泡沫盒，同时放入足够量的冰袋，密封后进行运输，使保证运输时冰袋中的冰不完全融化为准；(3)样品保存：在室温下解冻浸泡在TRIzol液体中的样品，于4℃12000rpm离心10min，吸取TRIzol液体至新离心管，将TRIzol液体放入‑80℃保存，保存期至少为1个月至毛囊RNA不被降解；(4)RNA提取：a)在室温下解冻由步骤(3)中冻存的TRIzol样品液体，向每1mLTRIzol样品中加入200μL氯仿，剧烈震荡混匀20s，于室温下静置5min；b)于4℃12000rpm离心15min，得上清，取400μL所得的上清至新的离心管；c)向所得的上清中加入400μL异丙醇，上下颠倒混匀10次，于室温下静置10min；d)于4℃12000rpm离心10min，可见管底有白色沉淀，弃液体，保留管底的白色沉淀；e)向离心管中加入1mL 75％浓度的乙醇溶液，用手指弹动离心管底，让沉淀悬浮于液体之中；f)于4℃7500rpm离心5min，弃液体，用枪头吸干管底残液，不要触及沉淀，避免将沉淀吸走；g)于室温下晾干沉淀后，用RNase‑Free ddH20溶解沉淀，得到绵羊毛囊组织总RNA样品。