[发明专利]病原体高通量检测基因芯片及其应用

摘要

本发明涉及的是一种病原体高通量检测基因芯片及其应用。芯片包括（1）病原体种类特异性基因、毒素基因及耐药基因的174条寡核苷酸探针组合；（2）寡核苷酸探针通过手臂分子固化在载体材料上形成的探针阵列。基因芯片包含基因探针174条，包括鼻疽伯克霍尔德氏菌和类鼻疽伯克霍尔德氏菌、布鲁氏菌、沙门氏菌、鼠疫耶尔森菌、炭疽芽孢杆菌、霍乱弧菌等8类病原体种类特异性基因探针32条；白喉毒素、志贺毒素、葡萄球菌肠毒素和霍乱毒素等7类毒素基因探针25条；超广谱β内酰胺酶、头孢菌素酶、碳青霉烯酶、整合酶类基因、常用基因工程载体耐药基因等17大类耐药基因探针117条。基因芯片可用于多种病原体种类特异性基因、毒素基因及耐药基因的检测。

主权项

一种病原体高通量检测基因芯片，其特征在于检测基因芯片包括（1）病原体种类特异性基因、毒素基因及耐药基因的174条寡核苷酸探针组合和质量控制探针；（2）寡核苷酸探针通过手臂分子固化在载体材料上形成的探针阵列；所述的寡核苷酸探针是指化学合成的多种基因序列的高度保守区的互补寡聚核苷酸，长度为十到五十个碱基；所述的病原体高通量检测基因芯片是指能检测病原体种类特异性基因、毒素基因及耐药基因的寡核苷酸阵列，8类病原体种类特异性基因包括鼻疽伯克霍尔德氏菌和类鼻疽伯克霍尔德氏菌、布鲁氏菌、沙门氏菌、鼠疫耶尔森菌、炭疽芽孢杆菌、土拉弗朗西斯菌、 志贺菌属和侵袭性大肠埃希菌（EIEC）、霍乱弧菌；7类毒素基因包括白喉毒素、志贺毒素、肉毒毒素、篦麻毒素、破伤风毒素、葡萄球菌肠毒素和霍乱毒素；17大类耐药基因包括超广谱β内酰胺酶、头孢菌素酶、碳青霉烯酶、整合酶类基因、四环素家族耐药基因、氨基糖甙类药物耐药基因、耐消毒剂基因、红霉素耐药相关基因、大环内酯类外排基因、耐万古霉素耐药基因、多药耐药外排泵基因、耐莫匹罗星基因、磺胺类耐药基因、泰洛星耐药基因、氟喹诺酮类药物耐药基因、氯霉素酰基转移酶、常用基因工程载体耐药基因；所述的质量控制探针至少包括两种探针，即阳性对照和阴性对照；阴性对照用于检测杂交信号错误或污染，阳性对照用于检测是否正常杂交的和准确定位；所述的手臂分子指具有双活性基团的长链有机化合物；所述寡核苷酸固定为寡聚核苷酸的末端有一特定基团，固化在载体材料基质表面时与表面修饰的手臂分子的末端基团形成共价键；所述的检测病原体种类特异性基因、毒素基因及耐药基因的174条寡核苷酸基因探针如下：病原体微生物的种类检测鉴定选择两组探针（每组正、负链），一组检测特异性结构基因保守序列，另一组检测关键性毒力基因；鼻疽伯克霍尔德氏菌和类鼻疽伯克霍尔德氏菌根据鼻疽假单胞菌和类鼻疽假单胞菌的基因序列选择结构保守序列16S rDNA和毒力基因flagellin C设计探针，每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针：16S rDNA正链探针5'‑NH2‑T(10)GGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGG16S rDNA负链探针5'‑NH2‑T(10)TTGCGGTTAGACTAGCCACTTCTGGTAAAACCCACTCCCATGflagellin C基因正链探针5'‑NH2‑T(10) TCAACAGCAACATTAACTCGTTGGTCGCTCAACAGAACCTCAflagellin C基因负链探针5'‑NH2‑T(10) TGTAGTTCGTCTGCGAAGCGATACGGTTCACTTCCGAGATC布鲁氏菌选择有1430个碱基的结构基因16S ribosomal特异序列和布鲁氏菌热休克蛋白31KD基因设计探针，每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针：16S ribosomal正链探针5'‑NH2‑T(10) CGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAAT16S ribosomal负链探针5'‑NH2‑T(10) CGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTC31KD基因正链探针5'‑NH2‑T(10) CGTAAGGATGCAAACATCAAATCGGTCGCAGACCTGAAAG31KD基因负链探针5'‑NH2‑T(10) AGAACCTTGGTGATGTTATAGATGAGGTCGTCCGGCTGCTTG沙门氏菌的hilA基因编码侵袭基因正调节蛋白，是inv基因的正转录调节蛋白；沙门氏菌的侵袭蛋白(invasion protein,inv)与沙门氏菌的致病性密切相关，它是由invA,invB.invC.invD和invE等一组基因编码，其中invA为沙门氏菌的主要毒力因子，序列保守，选择这两种基因设计探针，每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针：hilA基因正链探针5'‑NH2‑T(10) GCCGCAACCTACGACTCATACATTGGCGATACTTCCTTTTCAhilA基因负链探针5'‑NH2‑T(10) CCTCCTCCAACTGACCAGCCATGAAAAGATTCCAGCCATAATinvA基因正链探针5'‑NH2‑T(10) TTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGACAGAATCCTCAGTTTTTCAinvA基因负链探针5'‑NH2‑T(10) CCCCTCTTCATGCGTTACCCAGAAATACTGACTGCTACCTTGC鼠疫耶尔森菌的3a是一段特异的染色体序列，相关实验提示这段序列可作为鼠疫PCR检测的良好靶序列，探针设计参照Radnedge等报道的3a序列设计；另选择质粒上的毒力因子荚膜蛋白基因cafl设计探针，每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针：3a序列正链探针5'‑NH2‑T(10) TTGTATGGCACGGACAGAAACTTAGCAGTGAGGACTGGAAGC3a序列负链探针5'‑NH2‑T(10) ATATTACCGCCATGAAATGGACAATGATGCCCACCTAACCCTcafl基因正链探针5'‑NH2‑T(10) GGTACGCTTACTCTTGGCGGCTATAAAACAGGAACCACTAGCACAcafl基因负链探针5'‑NH2‑T(10) GCATCAGTGTATTTACCTGCTGCAAGTTTACCGCCTTTGGAACC   炭疽芽孢杆菌的毒力除决定于染色体基因外，还与毒素质粒(pXO1 )和荚膜质粒(pXO2)这两个编码质粒的致病因子有关；pXO1由三个部分组成：水肿因子(EF)、保护性抗原(PA)和致死因子(LF)；pXO2含CapB，CapC和CapA，编码荚膜蛋白，为正常毒力所必须；根据pXO1的水肿因子(EF)和pXO2设计探针，每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针：EF基因正链探针5'‑NH2‑T(10) GTGGCTACAAAGGGATTGAATGTTCATGGAAAGAGTTCGGATTGEF基因负链探针5'‑NH2‑T(10) TCTGCTGACGTAGGGATGGTATTTATTTTGGCTTTTGTAATCGGATCApXO2基因正链探针5'‑NH2‑T(10) AACTTAGAAGGCTGGTCAACAAGTGAAATTATGTCTCGTATGCGTCCApXO2基因负链探针5'‑NH2‑T(10) GAAGTACATGCGGATGGTGTCCCACAATAATATCTGCCCCTG土拉弗朗西斯菌探针根据Francisella 23kDa结构蛋白和外膜蛋白FopA基因设计，每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针：Francisella 23kDa基因正链探针5'‑NH2‑T(10) TGGTCTTACAACATCTCAAGGAAGCTTGCCAGTATGTTGCGCFrancisella 23kDa基因负链探针5'‑NH2‑T(10)TGAATGGTCTCGCCACTTGTTACCTGTTGTCTTGTTATCATCTCACTCFopA基因正链探针5'‑NH2‑T(10) CAACAGGTGCTTGGGATGTGGGTGGTGGTCTTAAGTTTGAACTATFopA基因负链探针5'‑NH2‑T(10) GCACCAATCATGTTAGTACCCGCTCTGCCATTAGCACCAGAAATAT志贺菌属和侵袭性大肠埃希菌（EIEC），以质粒和基因组中都存在的序列‑侵袭性质粒相关抗原(invasion plasmid antigen，ipa)的片段H为模板，存在多拷贝，易于检测；志贺氏菌中侵袭性相关基因ipaBCD是重要组成成分之一，为志贺菌侵入上皮细胞所必需的，ipaB－ipaC形成复合物，针对ipaC设计探针；每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针：ipaH基因正链探针5'‑NH2‑T(10) GCCCGCAGATTTACTTCTCCATGAGTGACGGACAACAGAATACipaH基因负链探针5'‑NH2‑T(10) GCATGGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTTCTATCTCATCCACAAAATipaC基因正链探针5'‑NH2‑T(10) CAAGTAGGTATAACGGGTATCGGTGCCAAAAAAACGCATTCAGGipaC基因负链探针5'‑NH2‑T(10) CAATGACAATTGAGAGCCCAATTTAGTTTCTGCAGTGCGGAGA编码霍乱弧菌外膜蛋白的基因(ompW)被认为是霍乱弧菌的标志基因，编码霍乱毒素A亚单位（CtxA基因）是霍乱肠毒素的活性部分；根据这两个基因设计探针，每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针：ompW基因正链探针5'‑NH2‑T(10) CGCTTGGCTATATGTTTACTGACAACATCAGTTTTGAAGTCCTCGCTCompW基因负链探针5'‑NH2‑T(10) CGTTAGCAGCAAGTCCCCATGAGTCGTCCAGTTTTAAATCACTCCtxA基因正链探针5'‑NH2‑T(10) GATATTGCTCCAGCAGCAGATGGTTATGGATTGGCAGGTTTCCtxA基因负链探针5'‑NH2‑T(10) GAAACATATCCATCATCGTGCCTAACAAATCCCGTCTGAGTTCCT七种毒素序列检测选择毒素的生物活性部分的探针；白喉毒素免疫毒素的细胞毒性源自DT的酶活性区和跨膜转运区，即N端389个氨基酸；其前193个氨基酸为白喉毒素(Diphtheria toxin , DT)A片段(DTA) 是白喉毒素的酶活性区，也是DT 类免疫毒素的关键结构域，根据其设计正负链探针各一条，共2条探针：DTA基因正链探针5'‑NH2‑T(10) TCAAAGTGACGTATCCAGGACTGACGAAGGTTCTCGCACTAAAADTA基因负链探针5'‑NH2‑T(10) AGTTAGCCCCAGCGAATACAGGATTGGTCCCAGTAACGGTTT在引起细菌性痢疾的志贺菌属中，以Ⅰ型痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae type I)引起的腹泻最为严重，主要原因是它能产生一种高水平的外毒素一志贺毒素(Shiga Toxin, ShT)，ShT具有肠毒性、细胞毒性和神经毒性等3种生物活性，根据其设计正负链探针各一条，共2条探针：ShT基因正链探针5'‑NH2‑T(10) GATTTAATGTCGCATAGTGGAACCTCACTGACGCAGTCTGTGGShT基因负链探针5'‑NH2‑T(10) CCATGATAGTCAGGCAGGACACTACTCAACCTTCCCCAGTTCAAT肉毒毒素是已知最剧烈的毒物，有嗜神经毒性，可以分为A、B、C1、C2、D、E、F、G、H八个型，各型毒素药理作用相同，但抗原性不同，只能被同型的抗毒素中和，选择了4个基因设计探针，每个基因选取正负链探针各一条，共8条：1、Clostridium botulinum neurotoxin BoNT gene       BoNT基因正链探针5'‑NH2‑T(10) TTGAGGAGTCACTTGAAGTTGATACAAATCCTCTTTTAGGTGCAGGCABoNT基因负链探针5'‑NH2‑T(10) GAGTAGAGCCATAACCATTTCGCGTAAGATTCAAAACTTCATGTCCA2、the gene of botulinum type B toxinB型基因正链探针5'‑NH2‑T(10) TGGAGGGCAAGATCCCAGCATCATAAGTCCTTCTACGGATAAAB型基因负链探针5'‑NH2‑T(10) GCTCCTGCAATCTCAAAAGCATTTTCAAAATTTCCTTTAGCTGTTTCA3、Clostridium botulinum bont/E gene for botulinum neurotoxin type E型基因正链探针5'‑NH2‑T(10) AGCAATGGATGTTTTTGGAACTTTATTTCTGAAGAACATGGATGGCAAE型基因负链探针5'‑NH2‑T(10) TCCATTTTTTAATGAAGTAGGCGGATGAAAATCTTGGGGGGTTGT4、Clostridium botulinum neurotoxin type F geneF型基因正链探针5'‑NH2‑T(10) TGCACTGCATGGATTATACGGGGCTAGGGGAGTTACTTATGAAGAF型基因负链探针5'‑NH2‑T(10) CGTTCTTTAATGAAGCCGGTGGATCAAAATCACTAGGATTCGTTCC篦麻毒素Ricin是一种从蓖麻种子的胚乳中提取的糖蛋白，由A、B两条肽组成的异二聚体，A链(RTA)分子量为30(或32)KDa，是一种糖苷酶；B链(RTB)的分子量为32 KDa，Ricin属核糖体失活蛋白，是一种细胞毒素，必须进入细胞才能发挥毒性，根据A链设计正负链探针各一条，共2条探针：RTA基因正链探针：5'‑NH2‑T(10) ACGAGAATTAGGTACAACCGGAGATCTGCACCAGATCCTAGCGRTA基因负链探针：5'‑NH2‑T(10) TGATTGTCAGGATGAAAGAAATATGCGCTATTTCCAGCACGGTAG破伤风毒素（Tetanus toxin）是一种强烈的神经毒素，由破伤风梭菌(Clostridium Tetani )产生，可被蛋白酶切成两条轻链)和一条重链，重链有与受体结合的功能而无毒性作用；毒素由一个75kb大质粒上一段核昔酸编码，编码基因长约4kb，为一大的开放读码框架，该基因分为A、B、C 3个片段，A片段编码毒性蛋白，B片段编码穿膜蛋白，C片段编码结合蛋白，基因工程做疫苗一般克隆的是无神经毒性的C片段，针对发挥毒性作用的轻链281－1651序列设计正负链探针各一条，共2条探针：正链探针：5'‑NH2‑T(10) ATCCAATAAGTGCTGAAGAACTATTCACTTTTGGCGGACAGGATGC负链探针：5'‑NH2‑T(10) TGTCCCAAATTCATACCTTTCCGGCACTATCCAAATACGATCTGTT产肠毒素性葡萄球菌具有多种毒力致病因子，其中最主要的是它所产生的A，B，C1，C2，C3，D和E七型热稳定性肠毒素(staphy‑lococcal enterotoxin，SE)，可引起人畜发生食物中毒，也能成为生物战毒剂的毒素，选择了4个基因设计探针，每个基因选取正负链探针各一条或通用探针，共9条：1、SEC1、SEC2、SEC3，以SEC2序列为参考SEC2基因正链探针5'‑NH2‑T(10) TTTTGGTATGATATGATGCCTGCACCAGGCGATAAGTTTGACCSEC2基因负链探针5'‑NH2‑T(10) TGTAAGTTCCCATTATCAAAGTGGTTTCCTTCATGTTTTGTTATTCCTCCA2、SEBSEB基因正链探针5'‑NH2‑T(10) ACCAGATGAGTTGCACAAATCGAGTAAATTCACTGGTTTGATGGAASEB基因负链探针5'‑NH2‑T(10) TCCTGGTGCAGGCATCATGTCATACCAAAAGCTATTCTCATTTTCT3、SEDSED基因正链探针5'‑NH2‑T(10) AAAATGTTACCGTACAAGAATTAGATGCACAAGCAAGGCGCTATTTGCSED基因负链探针5'‑NH2‑T(10) TGGAGTGACACCTCCATATGTACAAGCAGTCCTATCTATTTCACCACCAT4、SEA和SEESEA基因正链探针5'‑NH2‑T(10) TATGGTGCTTATTATGGTTATCAATGTGCGGGTGGTACACCAAACASEE基因正链探针5'‑NH2‑T(10) TCATAACTTACCGTGGACCCTTCAGAAGAATGAAACACAATCAAGCCSEA，SEE基因通用负链探针5'‑NH2‑T(10) TTCGCTTTTCTCGCTACCATTTACAAGTGGACTTGTTGTCAACGT霍乱毒素见微生物霍乱弧菌检测部分；耐药基因数目、分类复杂，部分序列变异而成为亚类的多见，因此在充分的同源性比较及分析的基础上，尽可能采取通用探针检测，在用通用性探针覆盖更多的耐药基因的情况下，同时重点对主要的，危害大的，易造成流行和对多药耐药而难以控制的，能做成生物战剂的一系列耐药基因进行全面检测；整合酶类基因探针选自Ⅰ类整合酶基因（IntI1）和Ⅱ类整合酶基因（IntI2），每个基因选取正负链探针各一条,共4条探针：intI1基因正链探针5'‑NH2‑T(10)CCAGTGGACATAAGCCTGTTCGGTTCGTAAACTGTAATGCAAGTAGC‑3'intI1基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CTCTACGACGATGATTTACACGCATGTGCTGAAAGTTGGCG‑3'intI2基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GGGCATTTAAAGCGATTTTCTGCGTGTTTATGGCTACATGTCTG‑3'intI2基因负链探针5'‑NH2‑T(10)ATGCTTGCGTTTGCGGGTTAAAGATTTTGATTTTGATAATGGCTG‑3'四环素家族耐药基因探针选择tetM基因,设计正负链探针各一条，Tet(M)是研究得最多的核糖体保护蛋白，具有核糖体依赖的GTP水解酶活性，共2条探针：tetM基因正链探针5'‑NH2‑T(10)AGTGGGAAAATACGAAGGTGAACATCATAGACACGCCAGGACA‑3'tetM基因负链探针5'‑NH2‑T(10)AAGCGGATCACTATCTGAGATTTCCAAAAGGGCATCAAGCAA‑3'氨基糖甙类药物耐药基因探针，选取了易于传播并且危害较大的氨基糖甙类修饰酶基因有aac(3)‑I、aac(3)‑II、aac(3)‑III、aac(3)‑IV、aac (6')‑I、aac(6')‑II、aphA6， ant(3')‑I和ant(2'')‑I共9种，每个基因选取正负链探针各一条, 共18条探针：aac(3)‑I基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GGTGCTTATGTGATCTACGTGCAAGCAGATTACGGTGACGATC‑3'aac(3)‑I基因负链探针5'‑NH2‑T(10)GAAAAGATCAAGAGCAGCCCTCATGGATTTGACTTGGTCAGG‑3'aac(3)‑II基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GTCGAAACTATAGCAAATGCTTACGTGAAGCTCGGTCGCCAT‑3'aac(3)‑II基因负链探针5'‑NH2‑T(10)AATCGAGAATGCCGTTTGAATCGTATTCTGATGCCGTTTTCC‑3'aac(3)‑III基因正链探针5'‑NH2‑T(10)TGGCTAAACTGGTGGCAATAGAAGGATACGTGCTGATGCTTG‑3'aac(3)‑III基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CTATCCGTATGACGCTGAGTCACCGAACCGTGATTCAAGC‑3'aac(3)‑IV基因正链探针5'‑NH2‑T(10)CTCAAGGAGAAGAGCCTTCAGAAGGAAGGTCCAGTCGGTCAT‑3'aac(3)‑IV基因负链探针5'‑NH2‑T(10)GTACCAACTTGCCATCCTGAAGAATGGTGCAGTGTCTCGG‑3'aac (6')‑Ib基因正链探针5'‑NH2‑T(10)ACTTGCTGACGTACAGGAACAGTACTTGCCAAGCGTTTTAGCG‑3'aac (6')‑Ib基因负链探针5'‑NH2‑T(10)ACTGGTCTATTCCGCGTACTCCTGGATCGGTTTCTTCTTCCC‑3'aac (6')‑II基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GGTGGGAAGATGAAACTGATCCAGGAGTGCGAGGAATAGACC‑3'aac (6')‑II基因负链探针5'‑NH2‑T(10)GTAGTGTTCCAGCACTTCATCAAGAGTCGGTCGCTCTTCGTC‑3'aphA6基因正链探针5'‑NH2‑T(10)TTGCCCAATATTATTCAACAATTTATCGGAAACAGCGTTTTAGAGCCA‑3'aphA6基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CGATTAAAAGAATAAACATCCGATGGCGACTGACCAATTTTATTTGGC‑3'ant( 3')‑I基因正链探针5'‑NH2‑T(10)TTGATCCGGTTCCTGAACAGGATCTATTTGAGGCGCTAAATG‑3'ant( 3')‑I基因负链探针5'‑NH2‑T(10)ACGGAATGATGTCGTCGTGCACAACAATGGTGACTTCTACAG‑3'ant(2'')‑I基因正链探针5'‑NH2‑T(10)TACAAAGCACATAGAGTCCTACAGGCTCGCATGCACCTCACTC‑3'ant(2'')‑I基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CATCGGCATAGTAAAAGTAATCCCAGATGATCGCCTCCCAGC‑3'耐消毒剂qacA/B家族基因探针，设计正负链探针各一条，共2条探针：qacA/B基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GATTTAGCTCATGTAGCTGAAGAATCTGTAGTGGGCGCTGTCGAA‑3'qacA/B基因负链探针5'‑NH2‑T(10)TGCCATGAAAATTGCTCAAGTAAAGCTCCTCCGATAATTGGTCC‑3'红霉素耐药相关基因探针，已发现Erm基因家族有20余种基因亚型，以ErmA，ErmB和ErmC三型为主，每个基因选取正负链探针各一条，共6条探针：ErmA基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GATCCCCTACGGCATCACCTCCGCCATCGTCGACTGGT‑3'ErmA基因负链探针5'‑NH2‑T(10)ACCCGTCGAGGAGCTGGAACAGCGTGATCCACTGGTCG‑3'ErmB基因正链探针5'‑NH2‑T(10)TTGAAAGCCATGCGTCTGACATCTATCTGATTGTTGAAGAAGGATTC‑3'ErmB基因负链探针5'‑NH2‑T(10)GCAAGAGCAACCCTAGTGTTCGGTGAATATCCAAGGTACGCTT‑3'ErmC基因正链探针5'‑NH2‑T(10)CGTGGAATACGGGTTTGCTAAAAGATTATTAAATACAAAACGCTCATTG                  GC‑3'ErmC基因负链探针5'‑NH2‑T(10)GGGTAAAATGCCCTTTTCCTGAGCCGATTTCAAAGATATTATCATGTTC‑3'大环内酯类外排（mefA）基因探针，设计正负链探针各一条，共2条探针：mefA基因正链探针5'‑NH2‑T(10)TACCCCAGCACTCAATGCGGTTACACCACTTTTAGTACCAGAAGAA‑3'mefA基因负链探针5'‑NH2‑T(10)TGCAATCACAGCACCCAATACGTCGATGGCAATAATAGCATTTAA‑3'耐万古霉素耐药基因探针，选用了由不同的耐药基因簇编码的VanA、VanB、VanC1、VanC2、VanD，VanE6种表型，每个基因选取正负链探针各一条，共12条探针：VanA基因正链探针5'‑NH2‑T(10)AAAATCTTAATTGAGCAGGCTGTTTTGGGCTGTGAGGTCGGT‑3'VanA基因负链探针5'‑NH2‑T(10)TACAAATCGCTGAGCTTTGAATATCGCAGCCTACAAAGGGGA‑3'VanB基因正链探针5'‑NH2‑T(10)ACGGAAGAACTTAACGCTGCGATAGAAGCGGCAGGACAATAT‑3'VanB基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CCGTATCAATGTTCGCAGCAATTTCTATTGCGGATTTTACCGA‑3'VanC1基因正链探针5'‑NH2‑T(10)CTTGAACTAATGAACCTGCCTTATGTTGGTTGCCATGTCGCTG‑3'VanC1基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CACAGTAGAACCGTAAGCAAAAGCAGTCGTTAATGCAGATTGGAGC‑3'VanC2基因正链探针5'‑NH2‑T(10)AAATCAATACTATGCCGGGCTTTACGAGTCACTCCCGCTATCC‑3'VanC2基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CGTCTACTAATGAAATGGCGTCACAAGCACCGACAGTCAAAGA‑3'VanD基因正链探针5'‑NH2‑T(10)AGGAACATGATGTTTCAGTGAAATCTGCGATGGAGGTTGCA‑3'VanD基因负链探针5'‑NH2‑T(10)ATGCGTGGATAACGGCTATAGGAAGTAAATCCAGGCATGGTGTTC‑3'VanE基因正链探针5'‑NH2‑T(10)CATGGAGGTTATGGTGAGAATGGTGCTATGCAGGGAGTATTTGAG‑3'VanE基因负链探针5'‑NH2‑T(10)TGTCGTTCCTTCAAATAGATACCAATGACCTTCTTCGGTGATCCCTA‑3'多药耐药外排泵基因探针，选择包括AcrAB‑ TolC，OprM和Sme DEF外排泵基因，每个基因选取正负链探针各一条，共6条探针：AcrAB‑TolC基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GCAGAAGTTCGTCCTCAAGTTAGCGGGATTATCCTGAAGCGT‑3'AcrAB‑TolC基因负链探针5'‑NH2‑T(10)TTCAGCAGGATTTTGCCGAACTCTTCAGTAGAGGTCAGACGC‑3'OprM基因正链探针5'‑NH2‑T(10)CCAAAAGAGGGCGGGATAGGCTAGAGCCCCTATAGCACTAGG‑3'OprM基因负链探针5'‑NH2‑T(10)GTAGCTGCGCTGGGTCAGGTCGAAACTCTTCTGGTAGGTG‑3'Sme DEF基因正链探针5'‑NH2‑T(10)AGTACCGATGGAAGTGATCCCCATGAAAAGTGCATCCCTGTT‑3'Sme DEF基因负链探针5'‑NH2‑T(10)GTTGGACGAGCTGTTGGAGGAGAAGTAGATCAGGCCATCAAG‑3'耐莫匹罗星（ileS）基因探针，设计正负链探针各一条，共2条探针：ileS基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GAGCCGATTCTTTAAGATGGGCCTTAATTTCGGATAGTGCTCCA‑3'ileS基因负链探针5'‑NH2‑T(10)TTTCTGGTTATCAAAAGGATAATGATGCTGAGCAAACGGCATAGAGC‑3'磺胺类耐药基因探针，选择了dfrA和dfrD两型，每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针：dfrA基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GGAAACCATTGCCAAATAGACGTAACGTCGTTCTCACTAACCAAGCT‑3'dfrA基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CGTCCCATTACAAGTGTATTCCCAGTGGTCAGTTGTTTAACATGCTTT‑3'dfrD基因正链探针5'‑NH2‑T(10)TTGTTGCGATGGATAAGAAAAGAGTAATCGGCAAGGATAACGACATTC‑3'dfrD基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CCCTTCCGATTGATTGAAGGTTCTTTCTACCTAATATGATTGCATGTCCT‑3'泰洛星（tlrB）耐药基因探针，设计正负链探针各一条，共2条探针：tlrB基因正链探针5'‑NH2‑T(10)CTACGGTCATGCGGAAGAACGTCGTGCGATATCTGCGCTGTC‑3'tlrB基因负链探针5'‑NH2‑T(10)AGCTTCGTCGGGCGTCTGAGCAGATTCACATAGCCCTGCC‑3'氟喹诺酮类（norA）药物耐药基因探针，norA基因介导的耐药在金葡菌中相当常见，设计正负链探针各一条，共2条探针：norA基因正链探针5'‑NH2‑T(10)TCCTCACAAAGCAACTACTGATGGATTCCACCAATATCAACCTGAA‑3'norA基因负链探针5'‑NH2‑T(10)TCGTCCAATAACCGTTTGCAAGCACTAACATAACGAGAACAATGG‑3'β内酰胺酶类（BLA）耐药基因探针，划分为超广谱β内酰胺酶、头胞菌素酶、碳青霉烯酶、金黄色葡萄球菌（MRSA）金标准mecA基因；其中超广谱β内酰胺酶（ESBLs）耐药基因，按不同编码基因同源性分为TEM型、SHV型、CTX‑M型（由于各亚型间CDS核酸基因序列差异较大，根据其序列的同源性分3组），PER型和VEB型，每个基因选取正负链探针各一条，共14条探针：TEM基因正链探针5'‑NH2‑T(10)TTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAA‑3'TEM基因负链探针5'‑NH2‑T(10)GCGTCAACACGGGATAATACCGCACCACATAGCAGAACTTTAA‑3'SHV基因正链探针5'‑NH2‑T(10)TAACAAAGCAGAGCGCATCGTGGTGATTTATCTGCGGGATA‑3'SHV基因负链探针5'‑NH2‑T(10)AGTAGTCCACCAGATCCTGCTGGCGATAGTGGATCTTTCGC‑3'CTX‑M1基因正链探针5'‑NH2‑T(10)ATGAGACGTTTCGTCTGGATCGCACTGAACCTACGCTGAATA‑3'CTX‑M1基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CCGCCATAACTTTACTGGTACTGCACATTGGAAAGCGTTCATC‑3'CTX‑M2基因正链探针5'‑NH2‑T(10)AAGAAGAGCGACCTGGTTAACTACAATCCCATTGCGGAGAAACA‑3'CTX‑M2基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CCCAGATGGGCAATCAGCTTATTCATGGCAGTATTGTCGCTAT‑3'CTX‑M3基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GCGGTGCTGAAGAAAAGTGAAAGCGAACCGAATCTGTTAAATC‑3'CTX‑M3基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CGTGAGCAATCAGCTTATTCATCGCCACGTTATCGCTGTACT‑3'PER基因正链探针5'‑NH2‑T(10)CGGCCACTAATGATTTAGGTATCATTCTGTTGCCTGATGGACG‑3'PER基因负链探针5'‑NH2‑T(10)GCACTGGAACACTAAACTCGTCTCCCTGATACGCTTTCATTATCGG‑3'VEB基因正链探针5'‑NH2‑T(10)AGATTACCCCTCAAGACCTTTTGCCTAAAACGTGGAGTCCGATTAAA‑3'VEB基因负链探针5'‑NH2‑T(10)TTTGATATTGGGTATTCCAATCCTTGTGCATTTGTTCTTCGTTTGCT‑3'头孢菌素酶（AmpC）耐药基因探针分为6组，几乎涵盖了所有的质粒AmpC基因序列，设计正负链探针各六条，共12条探针：AmpC基因正链探针第一条5'‑NH2‑T(10)AGCATCCAGCCGCTGCTCAAGGAGCACAGGATC‑3'AmpC基因负链探针第一条5'‑NH2‑T(10)GCCTGCTTCGGCACATTGACATAGGTGTGGTGCAT‑3'AmpC基因正链探针第二条5'‑NH2‑T(10)CCAGAACTGACAGGCAAAAAGTGGCAGGGTATCCGC‑3'AmpC基因负链探针第二条5'‑NH2‑T(10)GTTTTCTCCTGAACGTGGCTGGCATCCATGTTGGC‑3'AmpC基因正链探针第三条5'‑NH2‑T(10)CTTTCACAGGTGTGCTGGGTGCGGTTTCTGTGGC‑3'AmpC基因负链探针第三条5'‑NH2‑T(10)GTACGCATACTGGCTTTGCGCACTTTCCGGCACAGTAATAAA‑3'AmpC基因正链探针第四条5'‑NH2‑T(10)TATGGGTTAGCGGCAAAACAGCCTCAGCAGCCGGTTA‑3'AmpC基因负链探针第四条5'‑NH2‑T(10)AGACTTTTCGCCGCAATCATCCCTAGCAAACCAGTACCGATA‑3'AmpC基因正链探针第五条5'‑NH2‑T(10)CGCTTTTATCAAAACTGGCAGCCGCAGTGGAAGCC‑3'AmpC基因负链探针第五条5'‑NH2‑T(10)CGAGCTGCTTTTCAGGAATAAATGCCACGTAGCTGCCAAAC‑3'AmpC基因正链探针第六条5'‑NH2‑T(10)CATGGCGAACTATGCCTACGGCTATTCGAAGGAAGATAAGCC‑3'AmpC基因负链探针第六条5'‑NH2‑T(10)AACCCCATAGTTGAAATAGTGGGCCTTGCCATCTTTCAGCAC‑3'碳青霉烯酶耐药基因探针，选取了常见的基因型IMP1型及通用型、OXA23型、OXA24型，VIM型和GES2型，每个基因选取正负链探针各一条，共11条探针：IMP基因通用正链探针5'‑NH2‑T(10)CACTCCATTTACGGCTAAAGATACTGAAAAGTTAGTCACTTGGTTTGTGG‑3'   IMP1基因正链探针5'‑NH2‑T(10)CATTTTCATAGCGACAGCACGGGCGGAATAGAGTGGCTTAAT‑3'IMP1基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CCGCCTGCTCTAATGTAAGTTTCAAGAGTGATGCGTCTCCAAC‑3'OXA23基因正链探针5'‑NH2‑T(10)TTAAAATGTTGAATGCCCTGATCGGATTGGAGAACCAGAAAGC‑3'OXA23基因负链探针5'‑NH2‑T(10)TGATGAATCACCTGATTATGTCCTTGAACAATCTGACTCGGGGTTT‑3'OXA24基因正链探针5'‑NH2‑T(10)AATGGGTGTTACTCCACAGGTAGGTTGGTTGACTGGTTGGGT‑3'OXA24基因负链探针5'‑NH2‑T(10)GCTGACAATGCCATTGCCTCACCTAAAGTCATATCTTTCTCCCAC‑3'VIM基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GTGATGGTGATGAGTTGCTTTTGATTGATACAGCGTGGGGTG‑3'VIM基因负链探针5'‑NH2‑T(10)GTTGCGATATGCGACCAAACACCATCAGCAATCTGGTAAAGC‑3'GES2基因正链探针5'‑NH2‑T(10)CTGCGGTGCAGCTTAGCGACAATGGGGCTACTAACCTCTTAC‑3'GES2基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CCGCCATAGAGGACTTTAGCCACAGTACGTGCCATAGCAATAGG‑3'MRSA金标准mecA基因探针，选取正负链探针各一条，共2条探针：mecA基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GAACTCAAAATGAAACAAGGAGAAACTGGCAGACAAATTGGGTGG‑3'mecA基因负链探针5'‑NH2‑T(10)TGGTCTTTCTGCATTCCTGGAATAATGACGCTATGATCCCAATCTAACT‑3'常用基因工程载体耐药基因探针，包括氯霉素酰基转移酶（Cat）基因、博莱霉素（ Zeocin ）基因、杀稻瘟菌素（Bsr）基因、嘌呤霉素（Puromycin）基因、卡那霉素（Kana）基因，氨苄霉素（Amp）基因和四环素（Tet）基因，每个基因选取正负链探针至少各一条，共16条探针：Cat基因正链探针5'‑NH2‑T(10)CCTTGCAGCTTCATCATGCTGTATGTGATGGTTACCATGCTTC‑3'Cat基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CCAAGGAATCATTGAAATCGGTAGGGTGTTTTCAGGTATCGGTTT‑3'Zeocin基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTT‑3'Zeocin基因负链探针5'‑NH2‑T(10)TCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAGTGCACGCAGTTG‑3'Bsr基因正链探针5'‑NH2‑T(10)CCATTCATCTCAATGAGCACAAAGCAGTCAGGAGCATAGTCAGA‑3'Bsr基因负链探针5'‑NH2‑T(10)AGGTCGCCACTGAGAAGATCACCATGCTCTATGAGGACAACA‑3'Puromycin基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCT‑3'Puromycin基因负链探针5'‑NH2‑T(10)GGTGACGGTGAAGCCGAGCCGCTCGTAGAAGGGGAGGTT‑3'Kana基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAG‑3'Kana基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTAT‑3'Tet基因正链探针5'‑NH2‑T(10)CACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGG‑3'Tet基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CGTAGTCGATAGTGGCTCCAAGTAGCGAAGCGAGCAGGA‑3'Amp基因正链探针第一条5'‑NH2‑T(10)CACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGA‑3'Amp基因负链探针第一条5'‑NH2‑T(10)CGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTA‑3'Amp基因正链探针第二条5'‑NH2‑T(10)GCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCC‑3'Amp基因负链探针第二条5'‑NH2‑T(10)CGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTAT‑3'。