[发明专利]病原体高通量检测基因芯片及其应用

说明书

技术领域

本发明病原体高通量检测基因芯片及其应用涉及的是一种多种病原体和耐药基因的高通量检测基因芯片及应用。基因芯片包含各种基因探针174条，包括鼻疽伯克霍尔德氏菌和类鼻疽伯克霍尔德氏菌、布鲁氏菌、沙门氏菌、鼠疫耶尔森菌、炭疽芽孢杆菌、土拉弗朗西斯菌、志贺菌属和侵袭性大肠埃希菌（EIEC）、霍乱弧菌共8类病原体种类特异性基因探针32条；白喉毒素、志贺毒素、肉毒毒素、篦麻毒素、破伤风毒素、葡萄球菌肠毒素和霍乱毒素共7类毒素基因探针25条；超广谱β内酰胺酶、头孢菌素酶、碳青霉烯酶、整合酶类基因、四环素家族耐药基因、氨基糖甙类药物耐药基因、耐消毒剂基因、红霉素耐药相关基因、大环内酯类外排基因、耐万古霉素耐药基因、多药耐药外排泵基因、耐莫匹罗星基因、磺胺类耐药基因、泰洛星耐药基因、氟喹诺酮类药物耐药基因、氯霉素酰基转移酶、常用基因工程载体耐药基因等17大类耐药基因探针117条。可用于多种病原体种类特异基因、毒素基因及耐药基因的检测。本发明涉及的技术领域是医学检验和基因芯片技术。

背景技术                         

在各种可导致人类疾病的病原微生物中，病原细菌引起的传染病不仅在发病率方面居首位，同时也是造成人类死亡的重要原因。据报道，在任何时刻，估计世界各地有超过140万人患医院感染，且漏报率很高，给临床治疗造成很大困难，也构成了严重的公共卫生问题，给人民生命财产安全造成巨大的损失。随着不同病原体的药物的合成与大量使用，基因工程技术的进步使各种人造耐药菌成为可能。且随着环境污染日趋严重，一些以前从未见过的疾病，又给人类带来了新的威胁。快速、准确、灵敏、特异地对病原体作出诊断，是有效预防感染性疾病发生和控制其迅速传播的前提和关键。

目前，大多数卫生医疗机构使用的涉及培养、分离等的传统检验方法检测周期长，操作繁琐，在临床上难以及早进行病原学诊断和耐药性测定，无法满足临床救治危重感染者的需要。比如细菌的培养，根据不同的病原菌类型需要从18h到数天不等，对于个别细菌（如结核分枝杆菌）需要更长的时间，甚至需要专门的实验室生长条件。PCR、分子杂交技术和免疫测定等方法虽然能够节省检测的时间，有较好的特异性和灵敏度，但每次只能检测一种或少量的几种病原菌，要对众多样本进行检测需要做大量的工作，甚至难以实现。

基因芯片技术（Gene chip）于上世纪90年代发展起来，是将多种寡核苷酸分子固定于固相载体上形成DNA微阵列，将样品核酸用同位素和荧光等方法标记，与芯片探针杂交检测样本内的多种特异DNA序列，通过计算机系统分析，迅速得到获得样品中大量基因序列特征或基因表达特征信息。基因芯片为感染性疾病的临床诊断提供了有力的工具，与传统检测方法相比有多种优点：能同时进行高通量分析；无需机体免疫应答反应，能早期检测诊断；对检测样品需要量少，效率高；可用于大规模的病原体分类鉴定，毒素因子及耐药性检测等。因此，基因芯片在医学领域中已有了广泛的应用。

多种病原微生物的基因组序列已被阐明，各种各样的微生物基因被克隆、测序，为建立病原体高通量检测基因芯片奠定了基础。研制病原体高通量检测基因芯片，能快速鉴定病原体的种类，致病性及抗药性，为临床正确选用药物提供依据，对预防和控制病原菌感染和传播有重大意义。

发明内容

本发明目的是针对上述不足，提供一种病原体高通量检测基因芯片及其应用，制备一种能同时高通量检测多种病原体种类特异基因、毒素基因及耐药基因的基因芯片，可对多种病原体进行高通量快速检测。该基因芯片包含各种基因探针174条，其中鼻疽伯克霍尔德氏菌和类鼻疽伯克霍尔德氏菌、布鲁氏菌、沙门氏菌、鼠疫耶尔森菌、炭疽芽孢杆菌、土拉弗朗西斯菌、志贺菌属和侵袭性大肠埃希菌（EIEC）、霍乱弧菌共8类病原体种类特异性基因探针32条；白喉毒素、志贺毒素、肉毒毒素、篦麻毒素、破伤风毒素、葡萄球菌肠毒素和霍乱毒素7类毒素基因探针25条；超广谱β内酰胺酶、头孢菌素酶、碳青霉烯酶、整合酶类基因、四环素家族耐药基因、氨基糖甙类药物耐药基因、耐消毒剂基因、红霉素耐药相关基因、大环内酯类外排基因、耐万古霉素耐药基因、多药耐药外排泵基因、耐莫匹罗星基因、磺胺类耐药基因、泰洛星耐药基因、氟喹诺酮类药物耐药基因、氯霉素酰基转移酶、常用基因工程载体耐药基因等17大类耐药基因探针117条。上述探针是参照NCBI数据库提供的各类已发表病原微生物基因序列，依据基因探针设计原则筛选获得。该基因芯片可用于多种病原体检测、鉴定、合理用药、感染病监测及流行病学调查。

病原体高通量检测基因芯片及其应用是采取以下技术方案实现：