[发明专利]用于检测细胞骨架亚型基因的单细胞实时定量PCR检测方法及其应用

摘要

本发明涉及医学细胞和分子生物学领域，尤其是涉及一种用于检测细胞骨架亚型基因的单细胞实时定量PCR检测方法及其应用。一种用于检测细胞骨架亚型基因的单细胞实时定量PCR检测方法，该方法包括以下的步骤：1）重组载体pPCR-ScriptTMAMPSK(+)的构建；2）b-actin,g-actin,a-tubulin和b-tubulin基因的引物设计和PCR扩增；3）进行酶切和连接；4）制备RNA合成用的cDNA；5）实时定量PCR检测样品cDNAs；6）绘制样品mRNA的扩增和标准曲线。本发明建立的实时定量PCR检测体系，能对细胞内4ng总细胞骨架亚型基因RNA样本进行检测，具有高度的特异性和敏感性。

主权项

一种用于检测细胞骨架亚型基因的单细胞实时定量PCR检测方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：1)重组载体pPCR‑ScriptTM AMP SK(+)的构建；2)β‑actin，γ‑actin，α‑tubulin和β‑tubulin基因的引物设计和PCR扩增根据β‑actin，γ‑actin，α‑tubulin和β‑tubulin基因的核苷酸序列，Primer Express软件设计基因引物；PCR扩增出β‑actin，γ‑actin，α‑tubulin和β‑tubulin基因；3)进行酶切和连接；4)制备RNA合成用的cDNA①转化、质粒DNA提取、酶切和RNA合成；②反转录DEPC水倍比稀释RNA样品：1×109‑2；2μl样品RNA稀释液+8μl反应液混合后进行反转录：25℃10min，48℃30min，95℃5min；4℃保存；5)实时定量PCR检测样品cDNAs①Primer Express软件设计β‑actin，γ‑actin，α‑tubulin和β‑tubulin的实时定量PCR引物序列；②Primer Express软件设计β‑actin，γ‑actin，α‑tubulin和β‑tubulin的实时定量PCR探针序列；③实时定量PCR反应液：2μl样品cDNA+8μl反应液混合后进行：预变性       95℃    10min.变性         95℃    15sec.    45cycles退火/延伸    58℃    45sec.6)绘制样品mRNA的扩增和标准曲线。