[发明专利]与血清中刀豆素A特异结合的组织蛋白酶D酶原ConA-pCD及应用

摘要

本发明涉及一种与血清中刀豆素A特异结合的组织蛋白酶D酶原ConA-pCD，其由下述方法制得：①制备刀豆素A亲和层析柱，备用；②取血清，离心后取上清并加入糖蛋白结合缓冲液至终体积为0.5～5ml，然后转入上述制备好的刀豆素A亲和层析柱内，旋转摇床于室温孵育至少2h；然后离心弃流出液，加入含甲基-α-D吡喃甘露糖苷的糖蛋白结合缓冲液，旋转摇床孵育，离心并收集洗脱液；③在洗脱液中加入丙酮至终浓度为80%，-20℃过夜，离心弃上清，室温干燥后用蛋白裂解液溶解即可检测ConA-pCD。结果证实：血清ConA-pCD是一种潜在的、具有临床应用前景的新型肝癌诊断的血清标志物。

主权项

一种与血清中刀豆素A特异结合的组织蛋白酶D酶原ConA‑pCD，其特征在于，由下述方法制得：①制备刀豆素A亲和层析柱：在层析柱内加入100～1000 µl刀豆素A琼脂糖凝胶，离心弃去流出液，然后加入1～5 ml含0.1% Triton X‑100的糖蛋白结合缓冲液，旋转摇床孵育5～15 min，离心弃去流出液，再加入1～5 ml糖蛋白结合缓冲液，旋转摇床孵育5～15min，离心弃去流出液，备用；所述糖蛋白结合缓冲液组成为：30 mM Bis‑Tris, 150 mM NaCl, 1～5 mM CaCl2, 1～5 mM MnCl2, pH 6.0～7.2；②取血清，离心后取20～100 µl上清并加入糖蛋白结合缓冲液至终体积为0.5～5 ml，然后转入上述制备好的刀豆素A亲和层析柱内，旋转摇床于室温孵育至少2 h或于4℃孵育10～12 h；然后离心弃去流出液，加入0.5～2 ml含200～400 mM甲基‑α‑D吡喃甘露糖苷的糖蛋白结合缓冲液，即刀豆素A结合糖蛋白的洗脱液；旋转摇床孵育5～15 min,，离心并收集洗脱液，洗脱2～6次；③在上述收集的洗脱液中加入‑20℃的丙酮至丙酮体积终浓度为80%，‑20℃放置10～12h，离心弃上清，室温干燥后即得。