[发明专利]核酸内切酶DUF820-2的原核表达与制备方法及应用

摘要

核酸内切酶DUF820-2的原核表达与制备方法及应用，涉及核酸内切酶。从蓝藻Microcystis aeruginosa PCC7806染色体DNA上PCR扩增出DUF820-2基因，再克隆到表达载体pGEX-6p-1中，将重组质粒pGEX-DUF820-2转化大肠杆菌，实现DUF820-2在大肠杆菌中的诱导表达。将诱导表达菌用Ni-NTA琼脂糖树脂纯化得DUF820-2蛋白。DNA酶切实验表明，表达纯化的DUF820-2蛋白具有核酸内切酶的活性，在反应缓冲液中能酶切环状质粒DNA和染色体DNA。该酶在30～64℃温度范围内具有核酸内切酶活性。具有比现有市售的核酸内切酶更广泛的应用范围和前景。

主权项

核酸内切酶DUF820‑2基因的克隆和表达载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤：1)根据核酸内切酶的保守基序对铜绿微囊藻Microcystis aeruginosa PCC7806基因组序列进行保守结构域扫描，寻找具有核酸内切酶保守基序的蛋白，并对具有核酸内切酶保守基序的蛋白的序列进行分析，得到属于DUF820超家族的3个功能未知蛋白具有核酸内切酶的保守结构域，这3个蛋白分别命名为DUF820‑1、DUF820‑2和DUF820‑3，所述DUF820‑2蛋白含193个氨基酸，分子量为22.4，在GenBank中的登陆号为CAO88485.1，基因登陆号为AM778958.1，基因位置标签为IPF_1408，其基因序列见附录序列表中第1个DNA序列，氨基酸序列见附录序列表中第2个序列；2)核酸内切酶DUF820‑2基因的扩增，具体方法如下：根据DUF820‑2的基因序列设计合成如下两条引物P1和P2：P 1：5’‑CC CGGATCC CATATGTCTTTATCACTGATTACCC‑3’；P2：5’‑CC CTCGAG TTACCCCTTGATCTCACTTTTATTACC‑3’；以铜绿微囊藻Microcystis aeruginosaPCC 7806的染色体DNA为模板，P1和P2为引物进行PCR扩增，取扩增产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到的扩增产物大小约为580bp左右，与预期大小相吻合；3)表达载体pGEX‑DUF820‑2的构建，具体方法如下：将步骤2)中的扩增产物和载体pGEX‑6P‑1分别用BamHI和Xho I双酶切，酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，然后将回收产物用T4DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌，以Amp抗性筛选，获得重组载体pGEX‑DUF820‑2。