[发明专利]一种细菌亚硝酸盐还原酶活性测定方法

摘要

本发明公开了一种细菌亚硝酸还原酶活性测定方法，包括标准曲线的制作、细菌亚硝酸盐还原酶的提取、测定过程中所用的反应混合液的配制、细菌亚硝酸盐还原酶促反应及细菌亚硝酸盐还原酶活性的测定，即通过多孔板和酶标仪测定反应前、后亚硝酸盐溶液吸光值并根据标准曲线可测得酶促反应前、后NaNO2含量，再通过酶活力计算公式计算待测细菌亚硝酸盐还原酶的活力。本发明的一种细菌亚硝酸还原酶活性测定方法，在酶促反应后采用多孔板和酶标仪分析方法，即节省分析试剂的用量，同时节省人力和测试时间，大大提高了检测效率。

主权项

1.一种细菌中亚硝酸还原酶活性测定方法，其特征在于具体包括以下步骤：（1）、标准曲线的制作①、配制标准曲线制作所用试剂浓度0.2%(W/V)的盐酸萘乙二胺溶液：称取0.1g盐酸萘乙二胺，溶解于50mL蒸馏水中，混匀后，置棕色瓶中，避光4℃冰箱内保存，现用现配；浓度0.4%(W/V)的对氨基苯磺酸溶液：称取0.4g对氨基苯磺酸，溶于100mL 20﹪盐酸中，置于棕色瓶中混匀，避光保存；浓度0.2mg/mL的亚硝酸钠标准溶液：准确称取0.1000g于干燥器中干燥24h的亚硝酸钠，加蒸馏水溶解移入500 mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，混匀；浓度0.005mg/mL的亚硝酸钠标准液的稀释液：吸取浓度0.2mg/mL的亚硝酸钠标准溶液5.00mL，置于200mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度；②、标准曲线制作分别称取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0，2.5 mL浓度0.005mg/mL亚硝酸钠标准液的稀释液，分别置于25 mL容量瓶中，加蒸馏水20 mL左右，摇匀；每个容量瓶中分别滴加2 mL浓度0.4%(W/V)的对氨基苯磺酸溶液，混匀，避光静置3min，再分别加入1mL浓度0.2%(W/V)的盐酸萘乙二胺溶液，蒸馏水定容至25 mL，混匀，避光静置15min；将溶液用酶标仪在波长538nm处测定吸光值，并根据所得的吸光度与相应的亚硝酸钠浓度值绘制标准曲线；（2）、细菌中亚硝酸盐还原酶的提取①、细菌中亚硝酸盐还原酶提取所用溶液的制备  分别称取8g NaCl，0.2g KCl，1.44gNa₂HPO₄，0.24g KH₂PO₄，加入800ml蒸馏水溶解，再加入8.32g乙二胺四乙酸，用HCl调节pH值至7.4，再加入500μl吐温-20，1ml TritonX-100及4g聚乙烯吡咯烷酮，混匀后加蒸馏水定容至1L；②、细菌中亚硝酸盐还原酶的提取将细菌培养液用8000r/m离心收集菌体，每克湿菌加入10ml于4℃预冷1h的上述①中所得的细菌亚硝酸盐还原酶提取所用的溶液，冰浴超声波破碎菌体20min，每超声1秒停2秒，超声后取出15000r/m离心15min，取上清即待测细菌中亚硝酸盐还原酶蛋白样品液，于4℃保存待测试；（3）、测定过程中所用的反应混合液的配制分别称200mgNa₂S₂O₄、15mgNADPH、0.025g甲基紫精溶解于15ml 0.29M NaHCO₃ 溶液中，待全部溶解后即得测定过程中所用的反应混合液； （4）、细菌亚硝酸盐还原酶催化亚硝酸盐还原反应①、取1ml步骤（2）的②所得的待测细菌中亚硝酸盐还原酶样品液放入EP管，再加入1mL-2ml浓度为0.002 g /ml -0.02g/ml的NaNO₂溶液，轻轻摇晃振荡，加入0.5ml步骤（3）所得的反应混合液，37℃培养箱，避光静置1min后，取出加入5~10μl浓度为30%的H₂O₂，在摇床上，轻轻摇动5~8min，直至蓝紫色完全退去,立即放入90℃水中，3-5min后于15000r/m离心收集上清A；取上清A0.5ml放入2mlEP管中，加入0.5ml体积比即苯酚：氯仿：异戊醇为25:24:1的苯酚、氯仿和异戊醇组成的混合溶液，剧烈振荡后，15000r/m离心取上清B，再重复此步骤2次，最后离心所得上清c即为酶反应后待测亚硝酸盐溶液；②、取1ml蒸馏水放入EP管，再加入1mL-2ml浓度为0.002g/ml-0.02g/ml的NaNO₂溶液，轻轻摇晃振荡，加入0.5ml反应混合液，37℃培养箱，避光静置1min后，取出加入5~10μl浓度为30%的H₂O₂，在摇床上，轻轻摇动5~8min，所得溶液为酶反应前待测亚硝酸盐溶液； (5)、细菌中亚硝酸盐还原酶活性的测定①、反应前亚硝酸盐溶液吸光值的测定：吸取10μl-100μl步骤（4）中②所得的酶反应前待测亚硝酸盐溶液于多孔板的孔中，加蒸馏水100-190μl，摇匀，滴加15μl-30μl浓度0.4%(W/V)的对氨基苯磺酸溶液，混匀，避光静置3 min，再加入10μl -15μl浓度0.2%(W/V)的盐酸萘乙二胺溶液，混匀，避光静置15min，在波长538nm处测定吸光值，根据标准曲线可测得酶反应前的NaNO₂含量X1；②、反应后待测亚硝酸盐溶液吸光值的测定：吸取10μl-100μl步骤（4）中①所得的酶反应后待测亚硝酸盐溶液于多孔板的孔中，加蒸馏水100μl -190μl，摇匀，滴加15μl -30μl浓度0.4%(W/V)的对氨基苯磺酸溶液，混匀，避光静置3min，再加入10μl -15μl浓度0.2%(W/V)的盐酸萘乙二胺溶液，混匀，避光静置15min，在波长538nm处测定吸光值，根据标准曲线可测得酶反应后NaNO₂含量X2；再通过酶活力计算公式计算待测细菌亚硝酸盐还原酶的活力；酶活力计算公式如下：…………[1]Y：酶活力（U）   X1：酶反应前NaNO₂含量（μg/mL）   X2：酶反应后NaNO₂含量（μg/mL）t：酶催化时间（min）。