[发明专利]液相芯片检测大肠杆菌O157的方法

摘要

一种液相芯片检测大肠杆菌O157的方法，属于免疫技术及食品卫生检测技术领域。本发明的目的是提供一种采用液相芯片技术用于检测大肠杆菌O157的方法，以便实现对大肠杆菌O157的快速检测。本发明首先制备液相芯片，捕获抗体与微球偶联形成偶联体，然后应用液相芯片检测大肠杆菌O157。本发明运用液相芯片技术，提供一种用于检测大肠杆菌O157（EscherichiacoliO157）的方法，以便实现对大肠杆菌O157的快速检测，为食品安全做出贡献。液相芯片是集合流式细胞技术、激光技术、数字信号处理技术及传统化学技术为一体的新型生物分子检测技术，其最大的特点是高通量，灵活性好，灵敏度高。

主权项

一种液相芯片检测大肠杆菌O157的方法，其特征在于：由微球、捕获抗体、检测抗体、生物素标记的抗抗体、链霉亲和素‑藻红蛋白组成，其中微球是羧基化的21号微球、捕获抗体是大肠杆菌O157单克隆抗体、检测抗体是大肠杆菌O157的多克隆抗体、生物素标记的抗抗体是经活化的生物素标记的羊抗兔IgG，捕获抗体和检测抗体均能特异与大肠杆菌O157结合，以红色激光激发其球型基质上的红色分类荧光，以绿色激光激发与生物素标记的抗抗体相结合的藻红蛋白，测定球型基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球型基质上结合大肠杆菌O157的数量；液相芯片的制备：捕获抗体与微球偶联形成偶联体取微球原液室温恢复30min，用超声波清洗机进行超声10min，漩涡震荡30s，使微球均匀分布，用无菌水分别配制50mg/ml的EDC和NHS，然后取200ul 的微球原液置于1.5ml的离心管中，14000 rpm，离心5min，取出后弃上清，加入NHS和EDC各10ul，再加入80ul的活化缓冲液，混匀后，用铝箔纸包好，置于37℃摇床120 rpm，20min，然后14000 rpm，离心5min，小心移去上清，加入500ul稀释至250ug/ml的捕获抗体，重悬混匀，置于37℃摇床120 rpm，孵育2h，取出后离心弃上清，用500ul的PBS进行洗涤，洗涤后加入500ul 1％BSA的 PBS溶液，重悬微球，37℃水浴摇床孵育两个小时进行封闭，封闭后4℃保存；液相芯片检测大肠杆菌O157的方法：将已偶联的微球混合液室温恢复10min，漩涡振荡器震荡约3min，取约5000个微球，加入108 CFU/ml 的大肠杆菌O15710ul，用PBS‑TBN补足体积到100ul，置于37℃摇床120rpm，1h，取出后离心弃上清，用200ul PBS‑TBN洗两次，加入已稀释的检测抗体10ul，用PBS‑TBN补足体积到100ul，置于37℃摇床120rpm，1h，取出后离心，弃上清，用PBS‑TBN洗两次，然后加入已稀释的生物素标记的羊抗兔IgG 10ul，用PBS‑TBN补足体积到100ul， 置于37℃摇床反应1h，取出后离心弃上清，用PBS‑TBN洗两次，再加入SA‑PE，用PBS‑TBN补足体积到100ul，置于37℃摇床反应，取出后离心弃上清，用PBS‑TBN洗涤两次，重悬于100ul PBS‑TBN中，上机进行检测。