[发明专利]一种基于Caco-2细胞模型建立的中药活性成分指纹图谱质控方法

摘要

本发明涉及一种基于Caco-2细胞模型的中药活性成分指纹图谱质控标准的建立方法；旨在提供一种可操作性强，实验结果可信、可重复好基于Caco-2细胞模型的中药活性成分指纹图谱质控标准的建立方法；其技术要点是：1)制备药物供试品；2)建立Caco2单层细胞模型；3)药物的跨膜转运研究；4)对跨膜转运后的化学成分进行HPLC检测；5)比较黄连吴茱萸不同配比后有效物质的异同；比较代谢前后黄连吴茱萸指标成分的异同；6)建立中药黄连吴茱萸有效成分的指纹图谱质控标准；属于中药分析技术领域。

主权项

一种基于Caco‑2细胞模型的中药成分图谱质控标准的建立方法，其特征在于，该方法依次包括下述步骤：1)制备药物供试品按质量比1∶1、2∶1、6∶1称取黄连和吴茱萸，加入圆底烧瓶中，第一次加样品总质量8倍量水，浸30min；第二、三次分别加药品总质量4倍量水，沸腾后计时，每次1h，合并三次水煎液，浓缩至干，置真空干燥箱中减压干燥成粉，置4℃冰箱保存备用；2)建立Caco2单层细胞模型用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基于培养瓶中进行传代培养；将长势良好的细胞接种在Nunc插入式培养板上，种植密度为5×104个细胞·mL‑1；在浆膜层A面和粘膜层B面分别加0.5mL及1.5mL的培养基放入37℃孵箱中孵育；前14d隔天换液，以后每天换液1次，培养约21d，测定跨膜电阻值，当TEER＞1.5～2倍空白孔TEER值时，说明细胞达到汇合、分化形成单细胞层，用于实验；3)药物的跨膜转运研究Caco‑2细胞在Nunc插入式培养板上形成紧密完整的单细胞层后，各孔用HBSS液荡洗细胞3次；然后每孔加入2mL 37℃HBSS液，置于空气摇床上继续孵育1h，除去细胞表面的附着物，弃去HBSS液；药物用HBSS液稀释至最大细胞无毒浓度。药物从绒毛面侧至基底面侧的转运试验操作为：于AP侧加入0.5mL药物，B面加2.0mLHBSS液；置于37℃转速为50r·min‑1的空气摇床上，分别于载药后0，30，60，90，120，180min从B侧收集接受液0.5mL，并立即加等量HBSS液；药物从BL侧至AP侧的转运则将药物加入BL侧，AP侧加入空白的HBSS液，其它步骤同AP侧至BL侧的转运试验操作；考察受试液中成分在细胞层的吸收表达情况，并计算能表达的成分和特征的吸收速率；4)对跨膜转运后的化学成分进行HPLC检测5)建立中药黄连吴茱萸有效成分的指纹图谱质控标准。