[发明专利]一种异源蓝舌病毒双链RNA内源性干扰素诱导剂的制备方法

摘要

本发明公开了一种异源蓝舌病毒双链RNA内源性干扰素诱导剂的制备方法。该诱导剂是从动物蓝舌病毒中提取裸露的dsRNA分子制备而成的，直接用于人体，诱导人体产生内源性干扰素，赋予人体抗病毒、抗肿瘤以及广泛的防病、治病和增强体质的功能。主要优点：A）直接诱导人体产生种类齐全的ENI、体内浓度高、抗病毒和抗肿瘤活性最强、没有异源蛋白的免疫原性、没有依赖性、无须提纯、造价低廉。B）没有感染性；系dsRNA病毒，没有肿瘤源性；为天然病毒，不会影响生态平衡。C）是一种全新的对人安全的天然的绿色生物材料，用之不竭、可无限再生，便于离体增殖和纯化制备。D）高度符合种属特异性，在人体内的药理作用最强。

主权项

一种异源蓝舌病毒双链RNA内源性干扰素诱导剂的制备方法，其步骤如下：(1)细胞培养：以非洲绿猴肾细胞或幼仓鼠肾传代细胞为病毒扩增培养细胞，在37℃、5％CO2、10％小牛血清、DMEM培养基常规培养；(2)dsRNABTV增殖：待细胞长至80％‑90％汇合时，弃培养液，用pH 7.4的1×PBS洗涤贴壁细胞1‑2次，接种BTV病毒株悬液1.0ml于培养瓶，37℃吸附1‑2小时后，弃病毒液，以含2％小牛血清的添加DMEM培养基在37℃，5％CO2条件下维持培养，随后每12小时光镜下观察一次，至细胞出现明显细胞病变效应，即当CPE达90％时收获病毒；(3)dsRNA BTV的提取和纯化：收获培养的dsRNA BTV按中国专利ZL200410012605.9的“反向免疫共沉淀技术”工艺提取和纯化dsRNA BTV；(4)BTV dsRNA的提取：(a)PEG6000浓缩上述提取和纯化的BTV；(b)裂解液裂解BTV；(c)磁珠法提取BTV dsRNA；(d)蔗糖浓缩纯化的dsRNA；(e)‑20℃保存，备用；(5)病毒基因组dsRNA的鉴定：采用琼脂糖凝胶电泳技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，分析电泳图谱鉴定；(6)提取dsRNA纯度鉴定：采用紫外分光光度法结合聚丙烯酰胺凝胶电泳技术判断所提取dsRNA的纯度；(7)双链RNA浓度的测定：采用紫外分光光度法测定双链RNA含量；(8)制备成注射剂型，经肌内注射使用。