[发明专利]一种诱导提高丹参悬浮培养细胞中丹酚酸Ｂ产量的方法

摘要

本发明公开了一种诱导提高丹参悬浮培养细胞中丹酚酸Ｂ产量的方法，具体包括以1）培养无菌苗步骤；2）诱导愈伤组织步骤；3）愈伤组织继代培养步骤；4）愈伤组织悬浮培养步骤；5）诱导产生丹酚酸B步骤；6）收获培养细胞步骤。该方法克服了添加酵母提取物、寡半乳糖醛酸、真菌提取物等诱导子诱导后不产生丹酚酸B的问题，利用该方法可使丹参培养细胞中的丹酚酸B含量增加5倍左右。本发明中的工艺条件经放大后适宜于利用细胞培养法工业化大规模生产丹酚酸B。

主权项

一种诱导提高丹参悬浮培养细胞中丹酚酸Ｂ产量的方法，具体包括以下步骤：1）培养无菌苗步骤；2）诱导愈伤组织步骤；3）愈伤组织继代培养步骤；4）愈伤组织悬浮培养步骤；5）诱导产生丹酚酸B步骤；6）收获培养细胞步骤；所述培养无菌苗步骤是将新鲜的丹参种子用水冲洗2~4 h，用纱布去除表面的蜡质层，再用水冲洗3次，进行灭菌处理后用70%乙醇中冲泡30 s，无菌水冲洗3次，再用0.1%的HgCl2溶液中灭菌10~15 min，再用无菌水冲洗3次后，接种在MS固体培养基上，在培养温度为23～27℃、光照时间为10~12 h、光照强度为2000~3000 Lx的条件下培养2个月，长出无菌苗；所述诱导愈伤组织步骤是取出生长2个月的无菌苗，将叶片剪成0.5 cm × 0.5 cm的小块，接种于MS固体诱导培养基上诱导形成愈伤组织；所述愈伤组织继代培养步骤是将诱导出的愈伤组织每20 d继代培养一次，继代培养3次后形成具有稳定形态特征和生长速率的愈伤组织，然后在培养温度为23～27℃、光照时间为12~16 h、光照强度为2000~3000 Lx的培养条件下培养1个月，待用；所述愈伤组织悬浮培养步骤是选择新鲜疏松的固体愈伤组织，在无菌状态下分散，进行悬浮培养； 5）所述诱导产生丹酚酸B步骤是当培养细胞生长接近静止期时，向培养基中加入终浓度为6.25~25 mg/L的水杨酸诱导子进行诱导培养；6）所述收获培养细胞步骤是收集全部培养液，置离心管中，在1200×g 离心后，倾倒出上清的培养基，收集沉淀培养细胞，将培养细胞在40~60℃真空干燥箱中干燥至恒量。