[发明专利]一种肝素黄杆菌肝素酶I、II、III的制备方法

摘要

本发明提供肝素黄杆菌肝素酶I、II、III的制备方法，以肝素黄杆菌为原料，将肝素黄杆菌接到种子培养基中培养、再接到发酵培养基、离心收集沉淀、沉淀超声破碎、离心得到肝素黄杆菌肝素酶I、II、III的粗酶液，先将粗酶液通过一次SP-Sepharose FF层析分离为酶II和酶I、III，再将酶I、III再次过SP-Sepharose FF分离为肝素酶I和肝素酶III；将得到的酶I和酶III分别各再过SP-Sepharose FF两次，纯化得到高纯度的肝素酶I和III；将得到的酶II分别过HEP-Sepharose 4B、HA-Ultrogel、SP-Sepharose FF，得到高纯度的肝素酶II。

主权项

一种肝素黄杆菌肝素酶的制备方法，所述方法包括下述步骤：(1)肝素酶的粗酶液的发酵制备：将肝素黄杆菌从平板或斜面上刮取两环菌接到50ml种子培养基中，23℃，150rpm，培养1天，然后按5％接种量接入发酵培养基，23℃，150rpm，培养2‑3天。菌液10000rpm，4℃离心15‑30分钟，收集沉淀，悬浮在100ml、50mM Tris‑HCl①缓冲液中，冰浴超声1小时；4℃，10000rpm，离心30min，向其中滴加0.5g/ml的鱼精蛋白8ml，搅拌，4℃，10000rpm，离心30min，上清即为粗酶液；(2)粗酶的SP柱分离：将步骤(1)所得粗酶液上一根用10‑50mM的Tris‑HCl②平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，然后以缓冲液中氯化钠线形梯度0‑0.5M洗脱，分别收集洗脱液中具有肝素酶活性和硫酸乙酰肝素酶活性的洗脱液，两种酶呈两个活性峰I和II；将活性峰II洗脱液透析后上一根用50mM Tris‑HCl①缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris‑HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0‑0.2M洗脱，分别收集洗脱液中具有肝素酶活性和硫酸乙酰肝素酶活性的洗脱液，呈两种酶呈两个活性峰III和IV；(3)肝素酶I的纯化：步骤(2)活性峰III洗脱液透析后上一根用Tris‑HCl③缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris‑HCl③缓冲液中含氯化钠线形梯度0‑0.5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；上一根用50mM Tris‑HCl②缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris‑HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0‑0.5M洗脱，收集洗脱液中具有肝素酶活性的组分，以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，得到肝素酶I；(4)肝素酶III的纯化：步骤(2)活性峰IV洗脱液透析后上一根用Tris‑HCl④缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris‑HCl④缓冲液中含氯化钠线形梯度0‑0.5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；上一根用50mM Tris‑HCl②缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris‑HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0‑0.5M洗脱，收集洗脱液中具有硫酸乙酰肝素酶活性的组分以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，得到肝素酶III；(5)肝素酶II的纯化：步骤(2)活性峰I洗脱液透析后上一根用10mM Tris‑HCl⑤缓冲液平衡过的HEP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris‑HCl⑤缓冲液中含氯化钠线形梯度0‑0.1M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；然后上一根用50mM磷酸‑磷酸钠缓冲液平衡过的HA柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以缓冲液中含氯化钠线形梯度0‑1.5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；然后上一根用Tris‑HCl②缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris‑HCl②缓冲液中含氯化钠线形梯度0‑0.5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析，以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，得到肝素酶II。