[发明专利]一种肝素黄杆菌软骨素酶B和软骨素酶AC的制备方法

摘要

本发明提供了一种肝素黄杆菌软骨素酶B和软骨素酶AC的制备方法，以肝素黄杆菌为原料，将肝素黄杆菌接到种子培养基中培养、再接到发酵培养基发酵、离心收集沉淀、沉淀超声破碎、离心得到肝素黄杆菌软骨素酶B和软骨素酶AC的粗酶液，先将粗酶液通过一次硫酸铵沉淀去除部分杂质，然后通过OCTYL-Sepharose FF层析分离为酶B和酶AC两部分，再将酶B和酶AC分别各过三次SP-Sepharose FF纯化，得到高纯度的软骨素酶B和软骨素酶AC。

主权项

一种肝素黄杆菌软骨素酶的制备方法，所述方法包括下述步骤：(1)肝素黄杆菌的发酵：将肝素黄杆菌从平板或斜面上刮取两环菌接到50ml种子培养基中，23℃，150rpm，培养1天。然后按5％接种量接入发酵培养基，23℃，150rpm，培养2‑3天。菌液10000rpm，4℃离心15‑30分钟，收集沉淀，悬浮在100ml、50mM Tris‑HCl①缓冲液中，冰浴超声1小时，4℃，10000rpm，离心30min，上清即为粗酶液；(2)粗酶液的硫酸铵沉淀法粗纯化：向粗酶液中加硫酸铵至45％饱和度，4℃沉淀1小时，10000rpm，离心30min，向上清继续加硫酸铵至65％饱和度，4℃沉淀1小时，10000rpm，离心30min，取沉淀溶于含硫酸铵45％饱和度的Tris‑HCl①缓冲液；得粗纯化液；(3)粗纯化液的OCTYL柱分离：将步骤(2)所得粗纯化液上一根用含硫酸铵45％饱和度的Tris‑HCl①缓冲液平衡过的OCTYL柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，然后以缓冲液中含硫酸铵线形梯度45％‑0饱和度，分别收集洗脱液中具有软骨素酶B活性和软骨素酶AC活性的洗脱液，该两个洗脱液呈两个活性峰I、II；(4)软骨素酶B的纯化：步骤(3)活性峰I的洗脱液透析后上一根用50mM Tris‑HCl①缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris‑HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0‑0.5M洗脱，收集洗脱液中具有软骨素酶B活性的组分，透析后上一根用Tris‑HCl①缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris‑HCl③缓冲液中含氯化钠线形梯度0‑0.5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；上一根用50mM Tris‑HCl②缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris‑HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0‑0.5M洗脱，收集洗脱液中具有肝素酶活性的组分，以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，得到软骨素酶B；(5)软骨素酶AC的纯化：活性峰II洗脱液透析后上一根用50mM Tris‑HCl①缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris‑HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0‑0.5M洗脱，收集洗脱液中具有软骨素酶AC活性的组分，透析后上一根用Tris‑HCl④缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris‑HCl④缓冲液中含氯化钠线形梯度0‑0.5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；上一根用50mM Tris‑HCl②缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris‑HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0‑0.5M洗脱，收集洗脱液中具有硫酸乙酰肝素酶活性的组分以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，得到软骨素酶AC。