[发明专利]一种线性化表达载体构建方法及用于线性化表达载体构建的类载体片段

摘要

本发明提供了一种线性化表达载体构建方法及用于线性化表达载体构建的类载体片段，本发明的线性化表达载体构建方法包括下列步骤：设计并构建前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段；将前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段采用连接酶连接获得线性双链DNA表达载体。本发明还进一步提供了用于线性化表达载体构建的类载体片段。本发明通过高效准确的连接反应制备类似线性化载体片段，避开了通过繁琐耗时的环状质粒载体的构建而获得线性化载体片段的过程，同时目的基因末端的产生不受其序列的限制可以极大简化操作、降低成本并缩短实验周期，在酵母等表达系统中具有很好的应用前景。

主权项

一种线性化表达载体构建方法，包括下列步骤：1）设计前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段，所述前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段满足下列要求；所述目的基因片段含有目的基因且两个末端均为5’冗余粘性末端；所述目的基因片段的5’冗余粘性末端同时满足下列要求：a)单个5’冗余粘性末端的冗余碱基个数为2‑4个；b）两个5’冗余粘性末端的冗余碱基选自A、T、C和G中的至多三种，且任一冗余碱基均与目的基因片段中任一单链DNA的3’端首个碱基的互补碱基不同，冗余末端由T4DNA聚合酶降解产生；所述前类载体片段的一个末端为5’冗余粘性末端，且与所述目的基因片段中，编码链5’端对应的5’冗余粘性末端相互补，另一个末端为平端或者经去磷酸化酶处理的末端；2）所述后类载体片段的一个末端为5’冗余粘性末端，且与所述目的基因片段中，编码链3’端对应的5’冗余粘性末端相互补，另一个末端为平端或者经去磷酸化酶处理的末端；按照步骤1）的设计构建前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段，目的基因片段的构建包括下列步骤：A.设计引物扩增目的基因得到目的基因的PCR扩增产物；B.将目的基因的PCR扩增产物纯化后，利用T4DNA聚合酶产生5’冗余粘性末端；所述步骤B中，利用T4DNA聚合酶产生5’冗余粘性末端的方法为：将纯化的目的基因的PCR扩增产物在有碱基底物存在的反应体系中，用T4DNA聚合酶处理，最终获得带有5’冗余粘性末端的目的基因片段，所述碱基底物选自dATP、dCTP、dGTP和dTTP，并且必须含有待构建目的基因片段的两条单链DNA3’端的首个碱基相对应的碱基底物，而不得含有待构建的目的基因片段中任一冗余碱基的互补碱基相对应的碱基底物；3）将步骤2）构建的前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段采用连接酶连接获得前类载体片段、目的基因片段及后类载体片段依次相连的线性双链DNA表达载体，所述连接酶选自T4DNA连接酶或大肠杆菌连接酶。