[发明专利]用人羊膜间充质细胞作培养层来培养人源性人工诱导多潜能干细胞的方法

摘要

本发明涉及用人羊膜间充质细胞作培养层来培养人源性人工诱导多潜能干细胞的方法，它包括：用人羊膜间充质细胞的培养基，将体外的人羊膜间充质细胞培养在15cm的细胞培养瓶中达到80-90％融合；再加入人源性人工诱导多潜能干细胞培养基备用；将放在15cm细胞培养瓶中的人源性人工诱导多潜能干细胞吹打使其破碎成较小的干细胞的细胞团，放入人羊膜间充质细胞培养瓶中进行培养，待人胚胎干细胞生长到4mm-6mm，重复将上述干细胞吹打使其破碎成较小干细胞的细胞团放入新的人羊膜间充质细胞培养瓶中继续进行培养或用于其他目的使用，本发明得到与培养在MEF上的人源性人工诱导多潜能干细胞形态一致；而且用比MEF培养的更加安全。

主权项

一种用人羊膜间充质细胞作培养层来培养人源性人工诱导多潜能干细胞的方法，它包括以下步骤：(1)用人羊膜间充质细胞的培养基，将体外的人羊膜间充质细胞培养在15cm的细胞培养瓶中达到80‑90％融合；其特征在于：(2)去掉步骤(1)中的人羊膜间充质细胞的培养基，加入10ml新鲜人羊膜间充质细胞的培养基，在该培养基中加入100μl浓度为1mg/ml的丝裂霉素C混匀，然后将其放置于36.5‑37.5℃的CO2细胞培养箱中40分钟，去掉含有丝裂霉素C的培养基，再用10ml D‑Hank′s平衡盐溶液洗涤3次，再加入15ml的人源性人工诱导多潜能干细胞培养基备用；(3)将在15cm细胞培养瓶中生长到直径为4mm‑6mm的人源性人工诱导多潜能干细胞去掉多余的人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，只在细胞培养瓶保留5ml的人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，加入浓度为10mg/ml的胶原酶IV，使胶原酶IV的最终浓度为1mg/ml，混匀后置于36.5‑37.5℃的CO2细胞培养箱中15分钟，去掉含胶原酶IV的人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，用10ml Knockout DMEM洗涤3次后，再加入10ml人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，用5ml移液管对准克隆的人源性人工诱导多潜能干细胞快速吹打，使其脱落在培养基中，对于贴附紧密的人源性人工诱导多潜能干细胞，可用移液管轻刮人源性人工诱导多潜能干细胞，用机械力使其脱落，待人源性人工诱导多潜能干细胞全部脱落在培养基后，再次吹打使其破碎成较小的人源性人工诱导多潜能干细胞的细胞团，然后将其转移到4个预处理过的上述步骤(2)的培养瓶中，每瓶放入2.5ml；(4)在室温下，对步骤(3)培养瓶中的细胞进行培养，每隔1天更换一次人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，待3‑4天后长出肉眼可见的人源性人工诱导多潜能干细胞后，每天更换一次人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，每隔7天传代一次，待人源性人工诱导多潜能干细胞生长到4mm‑6mm，重复步骤(3)或经过步骤(3)破碎成较小的人源性人工诱导多潜能干细胞的细胞团后进行使用。