[发明专利]一种静电纺丝纤维膜固定化细胞检测水中酚类物质毒性的方法

摘要

一种静电纺丝纤维膜固定化细胞检测水中酚类物质毒性的方法。本发明属于静电纺丝纤维膜固定化细胞进行酚类物质毒性检测技术领域，具体涉及一种固定化细胞方法及其检测酚类物质毒性方法。该固定化细胞为接种有绿色荧光蛋白的大肠杆菌，以环境友好型高分子聚合物聚乙烯醇为原料，采用原位静电纺丝技术进行细胞固定。固定化细胞中的绿色荧光蛋白对2，4-二氯酚和五氯酚的响应不同，根据其荧光强度的变化可以检测酚类物质对此细胞的毒性。

主权项

一种静电纺丝纤维膜固定化细胞检测水中酚类物质毒性的方法，其特征在于：包括下列三个步骤：细胞的培养、电纺纤维膜固定化细胞的制备及利用其检测水中酚类物质毒性；1)细胞的培养：①取一管100μL DH5a感受态细胞，加入绿色荧光蛋白质粒1μL，混合均匀，冰浴中放置30min；②将管放到42℃水浴循环，热击90s；③将所述管转移到冰浴中2～5min；④向冰浴后的所述管中加入常温下700～800μL无抗性的SOB培养基，转入到摇床中，37℃下摇动1h；⑤取已转化的感受态细胞450μL加入到50mg/L卡那霉素抗性的培养基上，等培养基全部吸收后，于37℃下培养12～16h；⑥通过菌落PCR鉴定单菌落，确定含有能够表达绿色荧光的蛋白的质粒；⑦PCR鉴定完毕无误之后，挑选该单菌落接种于含有卡那霉素抗性的LB培养基中，37℃培养12～16h。2)电纺纤维膜固定化细胞的制备：将分子量为10万的聚乙烯醇颗粒和嵌段共聚物溶于超纯水中，均匀混合后加热搅拌至澄清，待此溶液冷却后，向其中加入一定量的步骤1)中培养的细胞，并将此混合溶液注入带有针头的5mL玻璃注射器，将注射器固定在注射泵上，纺丝电压调节至13.2kV，针头到接收板的距离设定为9cm，控制纺丝流速为0.2mL/h，纺丝时间3h，即得到所述电纺纤维膜固定化细胞。3)利用电纺纤维膜固定化细胞检测水中酚类物质毒性：将制备的固定有细胞的电纺纤维膜剪成1×1cm2大小相同的碎片放入96孔酶标板中，在对应的酶标板中以体积比为19∶1的比例加入一定浓度的酚类物质与M9培养基，在37℃下每5min对其荧光吸收进行测定，据荧光吸收的变化来确定酚类物质对细胞的毒性。