[发明专利]蜜蜂囊状幼虫病PCR及荧光PCR快速检测方法无效
申请号: | 201010163488.1 | 申请日: | 2010-04-30 |
公开(公告)号: | CN101956020A | 公开(公告)日: | 2011-01-26 |
发明(设计)人: | 王振国;宋战昀;刘和平;石建平;罗雁非;刘金华;魏春艳;肖成蕊 | 申请(专利权)人: | 中华人民共和国吉林出入境检验检疫局 |
主分类号: | C12Q1/70 | 分类号: | C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64 |
代理公司: | 吉林长春新纪元专利代理有限责任公司 22100 | 代理人: | 白冬冬 |
地址: | 130000 *** | 国省代码: | 吉林;22 |
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摘要: | 一种蜜蜂囊状幼虫病PCR及荧光PCR快速检测方法,属于生物领域。本发明目的是建立PCR检测方法,为蜜蜂囊状幼虫病诊断、防治、检疫以及蜂产品病原污染检测提供快速、准确、简便的蜜蜂囊状幼虫病PCR及荧光PCR快速检测方法。设计与合成蜜蜂囊状幼虫病PCR检测用引物、蜜蜂囊状幼虫病实时荧光PCR检测用Taqman探针及引物。本发明为我国蜜蜂囊幼病诊断、防治、检疫以及蜂产品病原污染检测提供快速、准确、简便的检测方法,为有效控制囊幼病的传播、降低蜂蜜中药物残留、提高蜂产品质量提供技术保障。 | ||
搜索关键词: | 蜜蜂 幼虫 pcr 荧光 快速 检测 方法 | ||
【主权项】:
一种蜜蜂囊状幼虫病PCR及荧光PCR快速检测方法,其特征在于:a、首先采集成蜂标本和幼虫标本;b、引物设计与合成:蜜蜂囊状幼虫病PCR检测用引物:SBV15’‑ACC AAC CGATTC CTC AGTAG‑3’SBV25’‑CCT TGGAAC TCT GCT GTG TA‑3’蜜蜂囊状幼虫病实时荧光PCR检测用Taqman探针及引物:SBV311F 5’‑AAGTTGGAGGCGCGTAATTG‑3’SBV380R 5’‑AAATGTCTTCTTACTAGAGGTAAGGATTG‑3’SBV331T 5’‑FAM‑CGGAGTGGAAAGATTATCTACAATCCTTACCTCTA‑TAMRA‑3’;c、(1)取单只蜜蜂,用PBS溶液清洗多次,尽可能弃去多余PBS,加入500μL Trizol试剂,用研磨器尽可能研磨,再加入500μL Trizol试剂,快速混匀,室温静置10min;(2)加入200μL氯仿,将盖子盖紧,用手剧烈振荡15s,室温静置10min;(3)4℃12000g离心15min,取上清液加等体积的异丙醇,颠倒混匀液体,室温静置10min;(4)4℃12000g离心15min,弃去上清,用1mL 75%乙醇洗涤RNA沉淀,振荡混匀,4℃,12000g离心10min;(5)弃去上清,在超净工作台上干燥10min;用20μL DEPC水溶解RNA沉淀,由于RNA易降解,故本试验每次将所提的RNA立即进行反转录,防止降解;d、将提取的病毒基因组RNA 10μL,通用引物2μL,离心混匀后煮沸变性10min,立即冰浴5min,以消除RNA的二级结构;各组分混匀,65℃作用10min,42℃反应90min,最后99℃5min,4℃5min以灭活反转录酶,整个过程完成后即可进行PCR。
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