[发明专利]一种制备高纯度胰激肽原酶的方法

摘要

本发明涉及一种制备高纯度胰激肽原酶的方法，该方法包括以下工艺步骤：(1)原料磨碎、加热反应；(2)提取；(3)盐析；(4)亲和层析分离纯化；(5)超滤浓缩除菌；(6)真空冷冻干燥，即可得到成品。与现有技术相比，本发明已建立起一套规模化生产的生产工艺，体现出了亲和层析法制备胰激肽原酶的高效性、专一性，有利于生产工艺的稳定可控，减少了生产成本，大大提高了产品品质，其中比活达到800单位/毫克蛋白以上、纯度达到90％以上，从而极大地提高了产品的市场竞争力。

主权项

一种制备高纯度胰激肽原酶的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)原料磨碎、加热反应：用研磨设备将新鲜冷冻猪胰直接磨成浆状，控制温度为40 60℃，加热搅拌反应4 5h，放置过夜，得到反应液；(2)提取：将反应液泵入提取桶，将反应液、纯化水和丙酮按体积比1∶3∶1混合，搅拌3 4h，再经过固液分离装置得到清液；(3)盐析：向步骤(2)得到的清液中加入硫酸铵至30％饱和度，在4℃冷库中放置过夜后过滤，得到提取液，在提取液中再补充硫酸铵至70％饱和度，在4℃冷库中放置过夜，弃去上清液后用离心法收集底层沉淀，得到粗品；(4)亲和层析分离纯化：将得到的粗品用纯化水溶解得到溶解液，将亲和层析介质装入分离柱，用缓冲液进行平衡后用溶解液上样，控制流速在30cm/h，上样完毕后继续用缓冲液冲柱至流出液的光密度OD280值小于0.1；换用pH为7.0，浓度为0.1mol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris HCl)及0.5mol/L KCl的混合缓冲液继续洗脱，控制流速为50cm/h，收集洗脱峰；(5)超滤浓缩除菌：对收集到的洗脱峰采用超滤膜进行浓缩，得到的浓缩液通过0.22μm的滤膜过滤除菌得到酶液；(6)真空冷冻干燥：将步骤(5)中得到的酶液置于冻干盘中，通过真空冷冻干燥对酶液进行冷冻干燥，即得到产品。