[发明专利]甘蔗杆状病毒检测方法

摘要

一种甘蔗杆状病毒检测方法，根据甘蔗杆状病毒基因组序列设计的特异性引物PC1/PC2，提取甘蔗叶组织的总DNA后，采用PCR扩增的方法，检测甘蔗杆状病毒，该方法克服了现有检测技术中的缺点，提供了一种快速、灵敏、特异检测甘蔗杆状病毒的方法。

主权项

一种甘蔗杆状病毒检测方法，其特在于包括以下步骤：(1)引物设计：根据GenBank数据库中已报道的甘蔗杆状病毒基因组序列的保守序列(序列登录号AJ277091和M89923)设计了扩增甘蔗杆状病毒的特异性引物PC1/PC2，扩增的目的片段大小为589bp，引物序列如下：PC1 5′ ACCAGATCCGAGATTACAGAAG 3′PC2 5′ TCACCTTGCCAACCTTCATA 3′(2)甘蔗叶组织总DNA抽提：①取0.5g甘蔗叶片放入研钵中，加适量液氮研磨至粉状后转至2ml离心管中；②在装有研磨物的离心管中加入800ul 65℃预热的CTAB抽提液，倒置混匀后放入65℃恒温浴锅中温育2hr，中间每隔20min颠倒离心管数次；③取出装有研磨物和CTAB抽提液的离心管置 20℃冷却2min；④加入600ul氯仿∶异戊醇＝24∶1混合液，充分混匀后室温静置30s，12000rpm/min离心6min；⑤取上清液500ul加入2/3体积的异丙醇，轻轻混匀； 20℃沉淀2hr；⑥室温下8000rpm/min离心6min；⑦弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤2次，室温风干；⑧沉淀用100ul灭菌去离子水溶解， 20℃保存备用；(3)PCR扩增在PCR管中按序加入以下试剂：ddH2O 7.6ul2×PCRTaq mix 10ulPC1(20umol/L) 0.2ulPC2(20umol/L) 0.2ulDNA模板 2.0ul加完后短速离心8～10秒后放进PCR仪，94℃预变性2min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后72℃延伸5min，4℃保存；(4)电泳检测：取10ul PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶，凝胶里预先加入0.5％的0.5ug/ml溴化乙锭，在0.5×TBE和140V的电压下电泳20min后，用BIO RAD凝胶成像系统观察；在感染甘蔗杆状病毒的蔗株中扩增到589bp的条带。