[发明专利]耐万古霉素肠球菌双重实时荧光PCR检测方法

摘要

本发明涉及耐万古霉素肠球菌双重实时荧光PCR检测方法以及试剂盒的组成，根据待测耐万古霉素肠球菌VanA、VanB两种抗性基因特异的核苷酸序列设计两对引物、两条不同荧光染料标记的探针，采用实时荧光PCR扩增待测两种万古霉素抗性基因的特异性核苷酸序列。本发明采用荧光双通道检测，检测用两种互不干扰检测波长，波长1检测探针FPVanA标记的荧光染料强度，波长2检测探针FPVanB标记的荧光染料强度，Ct值为0或大于37：阴性，Ct值小于36：阳性。本试剂盒针对耐万古霉素肠球菌而设计，具有特异性高、灵敏、快速等特点，可准确、快速、特异、方便的检出耐万古霉素肠球菌，并能够准确判断其耐药的遗传学机制。

主权项

1、一种双重实时荧光PCR检测耐万古霉素肠球菌的方法以及试剂盒的组成，根据待测耐万古霉素肠球菌VanA、VanB两种抗性基因特异的核苷酸序列设计两对引物、两条不同荧光染料标记的探针，采用实时荧光PCR扩增待测两种万古霉素抗性基因的特异性核苷酸序列。本发明采用荧光双通道检测，检测用两种互不干扰检测波长，波长1检测探针FPVanA标记的荧光染料强度，Ct值0或大于37：VanA阴性，Ct值小于36：VanA阳性；波长2检测探针FPVanB标记的荧光染料强度，Ct值0或大于37：VanB阴性，Ct值小于36：VanB阳性。本试剂盒针对耐万古霉素肠球菌而设计，具有特异性高、灵敏、抗污染、快速等特点，可准确、快速、特异、方便的检出耐万古霉素肠球菌，并能够准确判断其耐药的遗传学机制。按照权利要求1所述的双重实时荧光PCR检测耐万古霉素肠球菌的方法，其特征在于：所述双重实时荧光PCR扩增基因序列的反应体系为：5xPCR缓冲液(mix) 8μlP VanA(80pmol/μl) 0.5μlP VanB(80pmol/μl) 0.5μlFP VanA(60pmol/μl) 0.5μlFP VanB(60pmol/μl) 0.5μlTaq酶(2U/μl) 1μlUNG酶(0.1U/μl) 1μl模板 2～5μlddH2O 26～29μl总反应体积：40μl5XPCR缓冲液组成成分：250mM Tris-HCl(pH8.0)、15mM MgCl2、250mM KCl、3％的甲酰胺、1000uM dATP，1000uM dGTP，1000uM dCTP，1000uM dUTP，500uM dTTP。