[发明专利]非融合骨唾液酸蛋白的酵母表达载体及其应用

摘要

本发明公开了一种非融合骨唾液酸蛋白的酵母表达载体及其应用，属于基因工程和微生物发酵工程技术领域。本发明在构建的含人BSP全长cDNA的pB－hbsp质粒基础上，由人BSP基因的扩增、含有串联的两个表达盒的重组酵母表达载体pPICZαA－2×hBSP的构建与鉴定、重组酵母表达载体转化毕赤酵母GS115、GS115/pPICZαA－2×hBSP工程菌的甲醇诱导表达和目的蛋白的鉴定等步骤组成。本发明首次成功构建串联的非融合的重组人骨唾液酸蛋白基因(rhBSP)表达盒并在毕赤酵母GS115成功进行rhBSP的表达，为rhBSP的制备提供了一条简捷途径。

主权项

1、一种非融合骨唾液酸蛋白的酵母表达载体pPICZαA-2×hbsp，其特征在于是通过以下步骤获得的：1)根据GenBank中人骨唾液酸蛋白基因hbsp序列设计基因特异性引物：上游引物：5’-AGGAATTCGACTGCCAGAGGAAGCAATCAC-3’下游引物：5’-CGGAATTCACTGGTGGTGGTAGTAATTCTG-3’以骨唾液酸蛋白BSP基因为模板，应用RT-PCR技术从人股骨外膜组织的总RNA中扩增出BSP的cDNA，克隆至pBluescript II RI质粒中，构建重组质粒pB-hbsp；2)根据毕赤酵母分泌型表达质粒pPICZaA及hbsp序列设计PCR设计引物：上游引物：5’-CCG CTCGAGAAAAGA TTC TCA ATG AAA AAT TTG-3’下游引物：5’-GG GGTACC TCA CTG GTG GTG GTA GTA ATT CTG-3’以重组质粒pB-hbsp为模板进行PCR扩增，PCR产物与毕赤酵母表达载体pPICZaA重组，构建分泌型重组质粒pPICZαA-hbsp，再利用表达载体序列上的一对同尾酶BamH I和Bgl II构建含有BSP基因两个串连的表达盒的质粒pPICZαA-2×hbsp。