[发明专利]甘薯胚性悬浮细胞的遗传转化方法

摘要

一种甘薯胚性悬浮细胞的遗传转化方法，它包括以下步骤(1)胚性细胞悬浮培养系的建立、(2)菌株的活化及菌液的制备、(3)侵染和共培养、(4)选择培养和(5)转基因植株再生，建立了一个适合多种甘薯品种的胚性细胞悬浮培养系，该体系通过体细胞胚胎发生途径再生植株，植株再生率均为98％以上，达到用甘薯胚性悬浮细胞为转化受体，建立一个高效及适应性广的甘薯遗传转化体系。

主权项

1、一种甘薯胚性悬浮细胞的遗传转化方法，其特征是：它包括以下步骤：(1)胚性细胞悬浮培养系的建立：将长0.3-0.5mm的茎尖组织在添加1.0-3.0mg/L2，4-二氯苯氧乙酸、3.0％蔗糖和0.8％琼脂的Murashige和Skoog培养基上进行培养，培养条件为26～30℃，pH5.8，黑暗，培养6-8周后，将诱导得到的胚性愈伤组织破碎成小细胞团或单细胞，将其转移到含有1.0-3.0mg/L2，4-二氯苯氧乙酸的Murashige和Skoog液体培养基中，于水平摇床上90～120rpm进行振荡培养。培养条件为26～30℃、每日13小时、100～500Lx光照，悬浮培养物每7-10天继代1次；(2)菌株的活化及菌液的制备：将在4℃以下冰箱中保存的农杆菌在固体平板培养基上划线培养，使其活化，挑取培养2d的单菌落，在含有50mg/L的卡那霉素和125mg/L的链霉素的LiquidBacterium液体培养基中，250rpm下振荡培养，培养条件为26～30℃、pH值在6.8～7.4之间，黑暗，培养14～18小时后，将得到的悬浮培养物在固体平板培养基上划线培养，以进一步活化获得农杆菌单菌落。培养14～18小时后，将达到对数生长期的菌液置于离心管中，5000×g下离心5min收集菌体，最后将农杆菌悬浮于Murashige和Skoog液体培养基中稀释OD值为0.5～0.8；(3)侵染和共培养：将继代培养2-3天的胚性悬浮细胞用0.45mol/L的甘露醇在室温下进行高渗处理，将预处理过的悬浮细胞重新悬浮于制备好的菌液中，低速振荡10-15min，然后将菌液吸出，将侵染过的悬浮细胞重新悬浮于含有10-3.0mg/L2，4-二氯苯氧乙酸的Murashige和Skoog液体培养基中，进行共培养3-5天，培养条件为26～30℃，黑暗；(4)选择培养：将共培养后的胚性悬浮细胞用无菌水清洗2-3次，再用含有100-500mg/L羧苄青霉素的Murashige和Skoog液体培养基抑菌处理12小时，将侵染过的胚性悬浮细胞悬浮于含有1.0-3.0mg/L2.4-二氯苯氧乙酸、100-300mg/L羧苄青霉素以及50-75mg/L卡那霉素的Murashige和Skoog液体培养基中进行选择培养，培养条件为26～30℃，每日13小时及100～500Lx光照；(5)转基因植株再生：在选择培养基中，当胚性细胞团长至直径约0.5-2mm时，将其转移到含有相应抗生素的固体培养基上进行培养，使其增殖形成胚性愈伤组织和体细胞胚，培养条件为28℃、黑暗，转移6-8周后，将形成体细胞胚的胚性愈伤组织转移到添加0.5-1.5mg/L脱落酸、50-75mg/L卡那霉素以及100-300mg/L羧苄青霉素的Murashige和Skoog固体培养基上，使体细胞胚成熟并发芽，培养条件为26～30℃、每日13小时、2000～4000Lx光照；4-6周后，将再生的小植株转移到添加50-75mg/L卡那霉素、100-300mg/L羧苄青霉素的Murashige和Skoog基本培养上，使其形成完整的甘薯转基因植株。