本发明涉及一种用于检测和区分布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法。所述试剂盒包括用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的crRNA,序列如SEQ ID NO.1~2所示;或者用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的crDNA,序列如SEQ ID NO.3~4所示。本发明提供的检测和区分布鲁氏杆菌的试剂盒可以同时区分待测样品是牛种布鲁氏杆菌菌株、羊种布鲁氏杆菌菌株以及非羊种和牛种的其他布鲁氏杆菌菌株,有效解决了现有技术中布鲁氏杆菌菌株生物种分别鉴定区分的问题,为后续布鲁氏菌病的治疗提供了明确的指导。并且本发明提供的检测方法与传统的检测方法相对比特异性强、检测限低、灵敏度高,还具有价格便宜,操作简单、快速,且设备仪器方便携带的优点。