本发明涉及用于番鸭呼肠孤病毒、鹅呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒鉴别检测的三重RT‑PCR引物组及其试剂盒,引物组的序列如SEQ ID NO.1‑6。本发明的三重PCR反应,3组引物的添加量比为0.55:0.3:0.4。本发明建立了对三种水禽呼肠孤病毒的三重RT‑PCR检测方法,引物设计及反应条件的优化是多重PCR成功建立的关键技术,多重PCR主要存在的问题是扩增效率不均衡。本发明在引物选择上将片段大小的差距缩小,在引物筛选环节,设计了多对引物用于扩增MDRV、GRV和NDRV,最后筛选出扩增片段大小相近的3对引物,从而有效减少了扩增效率不均衡的影响,电泳结果表明目的条带准确、清晰、区分度强。