本发明属中药及中药材鉴定技术领域,为解决目前乌鞘蛇检测方法容易出现假阳性结果,无法应用于市场快速检测等问题,提供一种采用特异性引物鉴定乌梢蛇中药材真伪的实时荧光PCR方法,用于鉴别乌鞘蛇中药材真伪的特异性引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示;探针序列如SEQ ID NO:3所示。通过DNA快速提取、实时荧光PCR特异性扩增,即可完成对样品真伪的鉴别。本发明具有引物探针双重特异性其特异性更高、荧光检测灵敏度更高、无需电泳过程方法检测时间短,药典检测方法需要4小时左右,本方法仅需1.5h、所需仪器设备少可应用于快检车服务市场等优点。