本发明公开了一种用于检测呼吸道感染相关的病原微生物的组合物、试剂盒及检测方法。该用于检测呼吸道感染相关的病原微生物的组合物包括用于扩增甲型流感病毒、乙型流感病毒以及新冠病毒的引物及各自对应的探针,该引物及各自对应的探针序列分别为SEQ ID NO:1‑16所示,且组合物的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。本发明的组合物能够同时检测3种引起呼吸道感染的病原体,简便、快速、客观的对呼吸道病原体进行检测,从而实现明确病原、及早诊断、合理指导临床用药,减少医疗资源的浪费,降低患者和社会的心理负担。与此同时,其检出率比已有的呼吸道病原体检测组合物的检出率更高,检测更为准确。