本申请涉及生物技术领域,尤其涉及一种生物素化外源重组蛋白用表达载体及制备方法和应用;所述表达载体包括包括VV启动子,VV启动子用于替换表达载体的Tac启动子,VV启动子是通过改造AV3启动子所得的改造启动子,VV启动子的核苷酸序列包括与如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列同源性>90%的核苷酸序列;通过改造表达载体的AV3启动子得到VV启动子,并通过VV启动子替换表达载体上原始的Tac启动子,可以通过嵌合作用,提高表达蛋白的表达效率,因此可以通过改造启动子序列,改善表达载体在表达外源蛋白时的表达效率,从而提高表达载体在表达生物素化外源重组蛋白的表达率。