本发明公开一种鉴定三带喙库蚊的实时荧光PCR引物和探针及其应用。所述引物包手上游引物Culex-F和下游引物Culex-R,上游引物Culex-F的序列为SEQ ID NO.1所示的序列,下游引物Culex-R的序列为SEQ ID NO.2所示的序列;所述探针为Tritaeniorhynchus-P,MGB探针Tritaeniorhynchus-P的序列为SEQ ID NO.3所示的序列。利用上述引物和探针建立的实时荧光PCR检测方法能够快速、准确、特异的从海滨库蚊亚组蚊种中鉴定出三带喙库蚊,需要时可取单只蚊腿提取DNA进行鉴定,且可对蚊生活史各个阶段标本进行鉴定,对残缺标本也可进行鉴定。对实际工作而言,媒介鉴定工作无需媒介专家在场,可由一般实验人员进行,具有较好的推广应用价值。