本发明提供了一种人3型腺病毒的中和性人源化单克隆抗体及其制备方法和应用,该抗体基因含有如SEQ ID NO:43和44所述序列。本发明还提供了制备方法:扩增鼠源性单克隆抗体的轻链和重链序列;将轻链序列与人轻链恒定区序列和轻链信号肽连接,将重链序列与人重链恒定区序列和重链信号肽连接,轻链信号肽由人骨粘连蛋白信号肽所替换,重链信号肽由前胰蛋白酶信号肽所替换;再分别插入真核表达载体中,转染到细胞系。本发明提供的抗体基因含有如SEQ ID NO:43和44所述序列,并通过更换信号肽、提供适合的信号肽的组合,提高了人3型腺病毒中和性人源化单克隆抗体的产量,对研制高产量的可治疗感染性疾病的单抗有着重要意义。